通道抑制剂NVP与3-MA联合应用对肝癌细胞凋亡的影响

郭雪峰，常哲兴，罗钫月，郭华涛，王 影

(北华大学附属医院，吉林 吉林 132011)

肝癌是一种受多种风险因素影响的肿瘤[1].近年来肝癌的发病率和死亡率迅速上升，肝癌现存的治疗方法、疗效非常有限，仅有不到30%的患者可以得到有效治疗，即使切除了肿瘤，其复发率仍然非常高[2].由于患者本身具有化疗抗性，导致肝癌的治愈率非常有限，因此，发展新的有效治疗肝癌的方法势在必行.

1 材料和方法

1.1 材 料

3-MA 及DMEM培养基(Sigma公司)；牛血清(FBS，Gibco公司)；实验抗体(Santa Cruz生物技术公司)；通道抑制剂NVP-BEZ235(LC实验室).

1.2 细胞培养

人类肝癌细胞 Hep3B和 PLC-PRF-5在含有10% FBS的DMEM培养基中进行培养，培养条件：温度37℃，CO2的浓度为5%.

1.3 方 法

1.3.1 细胞活性检测

以1×104细胞/孔的浓度培养Hep3B和 PLC-PRF-5 细胞，每孔加入MTT试剂，继续培养4～6 h，然后每孔再加入150 μL DMSO.在490 nm 波长处检测吸光度，并记录.

1.3.2 Western blot 分析

将Hep3B应用凉PBS洗涤培养后，再用PIPA缓冲液进行消化.在4 ℃细胞溶解物下震荡、离心，提取上清液中的蛋白，应用BCA方法检测蛋白含量.行分离电泳，然后转印至PVDF膜上，在室温(25 ℃) 缓冲液中封闭2 h；加入一抗，在冰盒中摇晃过夜，然后在PVDF膜上与二抗室温孵育1 h.

将PLC/PRF/5细胞用凉PBS洗涤，然后用300 μL的PIPA缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)，0.1% SDS，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L正钒酸钠(Na3V4O)，1 mmol/L氟化钠(NaF)，1% Triton X-100，1% NP-40，1 mmol/L dithioth-reitol和1 mmol/L PMSF，1 μg/mL 抑氨酶，1 μg/mL 亮抑酶肽，1 μg/mL 胃酶抑素抗体)进行消化.细胞溶解物在4 ℃温度下震荡30 min，然后14 000 r/min离心10 min.应用BCA方法检测上清液中蛋白的浓度.在行Western检测时，取50 μg蛋白样本，在12%的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行分离电泳，然后转印至PVDF膜上，使用以5%的脱脂奶粉缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)，100 mmol/L NaCl和0.1% Tween-20 )室温(25 ℃)封闭2 h；加入一抗，在冰盒中摇晃过夜，然后二抗室温孵育1 h.

1.3.3 线粒体膜电位(MMP)分析

通过流式细胞术检测MMP的改变(JC-1染色)，应用胰酶消化收集两种肝癌细胞.应用PBS洗涤两次，然后将Hep3B和PLC-PRF-5细胞用3 μL的JC-1 (1 mg/mL)进行染色，37 ℃黑暗中孵育，再应用流式细胞仪对JC-1阳性细胞进行检测.

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 NVP在Hep3B和PLC/PRF/5细胞中的自噬

Hep3B细胞以100，250和500 nmol/L浓度的NVP处理24 h后，LC3和p62在Hep3B细胞中的表达见图1A；PLC/PRF/5细胞以100，250和500 nmol/L浓度的NVP处理24 h后，LC3和p62在PLC/PRF/5细胞中的表达见图1B；Hep3B细胞中的LC3-Ⅱ与p62蛋白定量见图1C；PLC/PRF/5细胞中的LC3-Ⅱ与p62蛋白定量见图1D.

图1NVP在Hep3B和PLC-PRF-5细胞中的自噬Fig.1NVP induces autophagy in Hep3B and PLC-PRF-5 cells

2.2 自噬抑制剂3-MA促进NVP诱导Hep3细胞凋亡

对Hep3B细胞按1.3.3中及2.1中的方法进行处理.结果见图2.经过250 nmol/L浓度处理的NVP，3-MA 和NVP-3-MA 24 h后LC3的表达见图2A；采用线粒体膜电位(MMP)分析法分析经NVP (250 nmol/L)，3-MA或NVP和3-MA 处理24 h后的Hep3B细胞活性见图2B；Western blot法检测经过250 nmol/L浓度处理的NVP，3-MA及NVP-3-MA 24 h后的Hep3B细胞中caspase-3、 分裂的caspase-3 与PARP的表达见图2C；分裂的caspase-3 与分裂的PARP 蛋白水平定量见图2D；经过NVP(250 nmol/L)，3-MA或NVP 和3-MA 处理24 h后，收集Hep3B细胞并用JC-1染色结果见图2E.

图2自噬抑制剂3-MA促进NVP诱导Hep3B细胞凋亡Fig.2Autophagy inhibitor 3-MA enhances apoptosis induced by NVP in Hep3B cells

2.3 自噬抑制剂3-MA促进NVP诱导PLC/PRF/5细胞凋亡

对PLC/PRF/5细胞按1.3.3中及2.1中的方法进行处理，然后进行分析.分析结果见图3.

按2.2方法处理24 h后，PLC/PRF/5细胞中LC3的表达见图3A；应用MMP法进行分析，经过NVP(250 nmol/L)，3-MA或NVP-3-MA处理24 h后PLC/PRF/5细胞活性见图3B；应用Western blot法进行检测，经过NVP(250 nmol/L)，3-MA或NVP-3-MA处理24 h后PLC/PRF/5细胞中的caspase-3、分裂的caspase-3与PARP的表达见图3C；分裂的caspase-3与分裂的PARP蛋白水平的定量见图3D；经过NVP(250 nmol/L)，3-MA或NVP-3-MA处理24 h后收集的PLC/PRF/5细胞及JC-1染色结果见图3E.

图3自噬抑制剂3-MA促进NVP对PLC/PRF/5细胞诱导的凋亡Fig.3Autophagy inhibitor 3-MA enhances apoptosis induced by NVP in PLC/PRF/5 cells

3 讨 论

在肝癌产生的分子机制中，许多信号通路对肝癌的发生都起到了关键作用，其中PI3K-AKT-mTOR信号通路在肝癌中异常活化，影响细胞的生存和增殖.在许多肿瘤中都会出现PI3K-AKT-mTOR通路的异常活化[3].有研究[4]显示：PI3K/AKT/mTOR通路抑制所引起的自噬能够引起细胞死亡，然而也有研究认为这种通路的抑制会引起治疗抗性.最近，前一种观点提出了自己的例证，那就是PI3K/AKT/mTOR能够通过促进自噬而增强肿瘤的放射敏感性；联合应用双功能PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235与mTORC1抑制西罗莫司脂化物(temsirolimus)能够在诱发大量的自噬反应，之后继而引起细胞死亡[5].相反，在临床前期模型中，人们认为自噬敲除能够增强PI3K/mTOR抑制剂所引发的凋亡.

然而以往的研究[6]发现：PI3K/AKT/mTOR通路抑制的结果并非仅此凋亡一项，尤其是在肿瘤细胞中，大量的基因变异已导致强烈的抗凋亡现象.最近的研究[7]显示：抑制肿瘤中的PI3K/AKT/mTOR能够引起自噬增强.Jung等[8]报道称：mTOR因其可以通过对其下游分子ULK的磷酸化而在自噬中起到重要调节作用.因此，可以想象，敲除mTOR能够引起自噬现象.

本研究数据表明：自噬能够增强由NVP-BEZ235引起的PI3K/mTOR通路受到抑制，导致肿瘤细胞生长受到抑制进而导致细胞凋亡，我们发现NVP-BEZ235与3-MA的联合应用能够明显抑制细胞的生长，并促进细胞凋亡，因此，自噬的活化极有可能与肝癌细胞的抗凋亡作用有关.自噬有可能帮助肿瘤细胞解除应急代谢压力，从而使其在凋亡的过程中生存下来.因此，我们认为抑制自噬极有可能会增强凋亡，从而成为一种新的抗肿瘤方法.本研究结果提示：自噬的抑制极有可能干扰了肿瘤细胞的增殖机制，继而对其生长产生抑制.本研究显示：自噬的抑制能够增加凋亡标志物caspase-3的活化，并促进肿瘤细胞的凋亡.实际上，此前的研究[9-10]显示：抑制自噬能够增强抑制剂引发的凋亡，这些发现与我们的假设相符合，即抑制自噬能够促进肝癌细胞的凋亡，并最终对其生长造成了抑制.基于以上结果，我们提出了一种新的更为有效的BEZ235抗瘤方法：敲除自噬.

凋亡与自噬的机制并不相同，因为他们各自具有差异非常明显的调节与效应分子[11-13].因此，凋亡与自噬之间的相互作用相对复杂，甚至有时候自相矛盾，一些情况下，自噬能够抑制凋亡从而维持细胞的生存[14]；然而也有一些时候，自噬能够联合凋亡机制或者独立地引起细胞死亡[15].最近研究[16]表明：自噬在肿瘤的发展与发生过程中扮演着重要角色，在程序性细胞死亡的过程中，自噬具有抗凋亡作用，但是否引发了非凋亡形式的程序性细胞死亡仍然有待探讨.