miR-210对肾细胞癌细胞迁移、增殖和凋亡能力的影响

颜国华 高鹏 王世广 王丽君

(1 郑州工业应用技术学院，河南 新郑 451100；2 河南中医药大学)

肾细胞癌(RCC)是肾脏中最常见的肿瘤。在西方国家，RCC的发病率在过去二十年中上升了约2%〔1〕。微小RNA(miRNA或miR)是一类保守的非编码RNA，其通过与3′-非翻译区中的序列结合而调节靶基因的表达水平〔2〕。研究表明，miRNA与各种癌症的发生发展和预后有关〔3〕。几种miRNA可能在RCC中失调，如与邻近的正常组织相比，miR-15a在RCC组织中显著下调〔4〕。此外，miR-15a的下调可通过在RCC进展期间直接靶向真核起始因子4E来抑制细胞增殖和侵袭〔5〕。miR-149-5p可能作为肿瘤抑制因子在RCC的细胞迁移，侵入和细胞凋亡中〔6〕。miR-210位于人类11号染色体上，miR-210在各种类型的癌症中异常表达，包括胰腺癌，宫颈癌，乳腺癌和RCC〔7〕。然而，miR-210在RCC中的作用的分子机制仍有待阐明〔8〕。本研究拟探讨RCC组织中miR-210的表达及其对RCC细胞的迁移、增殖和凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1材料 人肾小管上皮细胞HK2和RCC(ACHN，786-O，Caki-1和769P)细胞系由实验室常规保存。ACHN细胞使用DMEM培养基。786-O和769P细胞在RPMI1640培养基中培养。Caki-1细胞在McCoy 5A培养基中培养。此外，细胞培养时补充10%胎牛血清，1%谷氨酰胺和1%抗生素(100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素)37℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2RNA提取和逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR) 使用TRIzol试剂(Invitrogen;Thermo Fisher Scientific)提取来自细胞的总RNA，并使用RNeasy Maxi试剂盒进行纯化。在使用NanoDrop 2000c测量RNA浓度后，使用miScript Ⅱ RT试剂盒，将RNA逆转录成cDNA，进行qPCR。10 μl反应混合物由5 μl 2×QuantiTect SYBR Green PCR Master mix，3.7 μl无RNase水，1 μl cDNA模板，0.4 μl特异性miRNA引物和10×miScript Universal Primer组成。miR-210的引物是5′-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGAAGCCGCUGUCACACGCACAGUU-3′。U6(剪接体U6小核RNA)被选为内参，U6引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。使用2-ΔΔCt法分析细胞中miR-210表达水平〔9〕。

1.3细胞转染 miRNA mimics可以增强内源miRNA的调节。转染miR-210 mimics可以让786-O和ACHN细胞的miR-210表达上调，使用Lipofectamine 2000转染，细胞使用Opti-MEM培养基进行培养。

1.4噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力 分别将5 000个/孔786-O和ACHN细胞接种在96孔板中。转染后总共3 d，在37℃下各孔加入20 μl MTT 4 h后除去上清液，向各孔中加入100 μl二甲基亚砜。然后使用振荡器以0.16 g/min在室温下，避光下震荡10 min。使用酶标仪在595 nm的波长下评估细胞活力。实验重复3次。

1.5细胞计数试剂盒(CCK)-8测定细胞增殖 将5 000个/孔786-O和ACHN细胞接种在96孔板中，然后用miR-210 mimic，miRNA(NC)mimic转染。每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃、5%CO2的培养箱中温育30 min。将细胞孵育0、24、48和72 h后，使用酶标仪测量450 nm处的吸光度来确定细胞增殖。实验重复3次。

1.6细胞划痕实验评估ACHN和786-O细胞的迁移能力 在6孔板的每个孔中接种总共1×106个细胞。在转染前细胞饥饿处理24 h。然后，如上所述，用miR-210 mimics、NC mimics转染细胞。转染后，将细胞在无血清和抗生素的培养基中于37℃培养24 h。接下来，通过拖动无菌移液管尖端造成划痕。使用相机系统在0、12和24 h，37℃下捕获细胞划痕图像〔10〕。实验重复 3 次。

1.7使用24孔Transwell小室评估ACHN和786-O细胞的迁移和侵入能力 转染后24 h，将约3×104个细胞铺在上室。Transwell的下室含有600 μl补充有10%胎牛血清和1%谷氨酰胺的培养基(DMEM或RPMI1640)。在48 h，使用0.1%多聚甲醛将细胞固定25 h，并使用4%结晶紫室温下染色25 min〔11〕。使用相机拍摄图像。实验重复3次。在4个随机选择的视野中对细胞进行计数。

1.8流式细胞术评估ACHN和786-O细胞的凋亡率和细胞周期 将1×106个细胞接种在6孔板中。在24 h，如上所述用miR-210 mimics，NC mimics 转染细胞。在转染后48 h，收获细胞并使用冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤。用5 μl膜联蛋白V-荧光素异硫氰酸酯(FITC)和碘化丙啶(PI)染色细胞。使用流式细胞仪评估细胞凋亡情况。对于细胞周期分析，收获1×106个细胞，用70%乙醇固定过夜。然后将细胞用含有Rnase Ⅰ(100 μg/ml)和PI(50 μg/ml)及含有0.1%Triton X-100的PBS，在37℃下染色30 min。通过流式细胞术进行细胞周期分析。软件FlowJo7.6.1用于分析数据〔12〕。实验重复 3 次。

1.9统计学处理 采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1miR-210的表达水平在RCC细胞系中上调 miR-210在RCC细胞系786-O(11.23±0.32)、ACHN(8.62±0.43)、Caki-1(4.62±0.35)、769P中的表达水平(2.53±0.22)均显著高于正常肾小管上皮细胞HK2(1.24±0.23，P<0.05) 。转染后24 h，786-O细胞、ACHN细胞中miR-210 组 miR-210的表达水平(108.25±7.21、102.46±5.24)均显著高于NC组(2.52±0.41，2.07±0.51，P<0.05) 。

2.2miR-210上调促进ACHN和786-O细胞的活力 与NC mimic组(OD值：0.43±0.02)相比，用miR-210 mimic转染的ACHN细胞相对存活率(OD值：0.86±0.05)明显增加(P<0.05)。与NC mimic组(OD值：0.52±0.04)相比，转染miR-210 mimic的786-O细胞相对存活率(OD值：0.78±0.06)明显增加(P<0.05)。

2.3miR-210上调促进ACHN和786-O细胞增殖 在转染后24、48和72 h，转染miR-210 mimic的ACHN和786-O细胞存活率显著上调(P<0.05)。见表1。

2.4miR-210调节ACHN和786-O细胞的侵袭 与NC mimic组〔(0.86±0.07)个〕相比，转染miR-210 mimic的ACHN细胞侵袭能力显著上调〔(1.56±0.08)个，P<0.05〕。与NC mimic组〔(0.74±0.06)个〕相比，转染miR-210 mimic的786-O细胞侵袭能力显著上调〔(1.82±0.01)个，P<0.05〕。见图1。

表1 miR-210对ACHN和786-O细胞增殖能力的影响值)

与NC mimic组比较：1)P<0.05；下表同

图1 miR-210对ACHN和786-O细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色，×100)

2.5miR-210调节ACHN和786-O细胞的迁移 与NC mimic组〔(0.89±0.03)μm〕相比，miR-210 mimic组ACHN细胞的迁移能力〔(1.30±0.07)μm〕显著上调(P<0.05)。与NC mimic组〔(0.91±0.04)μm〕相比，miR-210 mimic组786-O细胞的迁移能力〔(1.26±0.08)个〕显著上调(P<0.05)。见图2。

2.6miR-210的上调抑制ACHN和786-O细胞的凋亡 与NC mimic组〔(17.81±0.45)%〕相比，miR-210 mimic组ACHN细胞早期凋亡率〔(12.61±0.36)%〕显著降低(P<0.05)。与NC mimic组〔(21.50±0.52)%〕相比，miR-210 mimic组786-O细胞早期凋亡率〔(14.60±0.48)%〕显著降低(P<0.05)。见图3。

图2 转染前和转染后24 h miR-210对ACHN和786-O细胞的迁移能力的影响

图3 miR-210对ACHN和786-O细胞凋亡的影响

2.7miR-210的上调对ACHN细胞周期的影响 与NC mimic组相比，miR-210 mimic组ACHN细胞在G1 期的百分比明显降低(P<0.05)，在G2 期和S期的百分比明显升高(P<0.05)。见表2，图4。

表2 miR-210对ACHN细胞周期的影响

图4 miR-210对ACHN细胞周期的影响

3 讨 论

RCC是世界范围内最常见且致命的恶性肿瘤之一〔1〕。然而，RCC发生和进展中涉及的机制仍不清楚〔13〕。RCC通常对放疗和化疗法具有抗性，到目前为止诊断为转移性的RCC患者不存在治愈性疗法，并且在局部手术切除肿瘤仍然是治疗的主要手段〔14〕。miRNAs在转录水平后负责调控基因表达，在肿瘤学中被广泛研究。因为它们可以调控细胞的行为和肿瘤微环境。由于单个miRNA可能靶向数百个mRNAs〔15〕，异常的miRNA表达可能会影响大量的转录本，而且会影响癌症相关的信号通路〔2,16,17〕。

miR-210在过去几年中已被大量研究，已经被鉴定了多种miR-210靶标，并指出其不仅在线粒体代谢中，而且在血管生成、DNA损伤应答、细胞增殖和细胞凋亡中的作用〔7〕。miR-210通常表现出致癌性，因为它经常在几种癌症中升高，包括乳腺癌、肺癌、肾细胞癌、胰腺癌或胶质母细胞瘤等等〔18〕。研究显示，RCC患者尿液中miR-210的水平显著高于正常组，被作为RCC中液体活检的标志〔19〕；在临床RCC组织中，miR-210-3p通常被上调〔20〕。靶向miR-210-3p并利用规律成簇间隔短回重复(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除RCC细胞系中的miR-210-3p，miR-210-3p下调导致体外和体内肿瘤发生增加〔21〕。下调miR-210-3p导致Twist相关蛋白(TWIST)1显著上调，这是miR-210-3p的关键靶点，表明miR-210-3p介导的TWIST1促使肾细胞癌进展〔22〕。miR-210过表达在肾癌细胞中诱导中心体扩增，并影响与细胞周期调节相关的基因。miR-210控制G2/M转换并参与有丝分裂过程，改变丝氨酶/苏氨酸蛋白激酶酶(Plk)1，纺锤体检测点蛋白(Bub1B)，细胞周期(cyclin)F，姐妹染色单体内聚蛋白PDS5同源蛋白B和序列相似83家族D的表达〔23〕。此外，miR-210通过靶向E2F转录因子3的表达参与S期的中心体复制，事实上，miR-210过表达抑制E2F转录因子3的表达，并影响中心体复制周期的调控，可能导致中心体非整倍数扩增〔24〕。

本研究表明miR-210可能在RCC中起致癌基因的作用，但是具体在RCC中miR-210的相关靶点未能确定，具体详细的机制有待进一步研究。