淫羊藿苷对局灶节段性肾小球硬化模型大鼠泼尼松抵抗的影响

陈威辛 戴恩来 王新斌 薛国忠

摘要：目的  觀察淫羊藿苷对局灶节段性肾小球硬化（FSGS）模型大鼠泼尼松抵抗的影响，探讨其可能的作用机制。方法  48只Wistar雄性大鼠随机分为对照组（10只）和造模组（38只），大鼠尾静脉注射阿霉素（6.0 mg/kg）制备FSGS模型，大鼠尿蛋白>100 mg/24 h并随机选取2只造模大鼠的肾组织病理为FSGS提示造模成功，其余36只大鼠随机分为模型组（10只）、泼尼松组（10只）、淫羊藿苷组（8只）、泼尼松联合淫羊藿苷组（联合组，8只），给予相应药物灌胃干预6周，称重，检测24 h尿蛋白（24 h-UTP）、尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、胆固醇（CHOL）、三酰甘油（TG）、皮质醇（COR）、尿17-羟皮质醇（U17-OHCS）水平，HE和Masson染色观察肾组织病理变化，Western blot和RT-PCR分别检测Nephrin、Podocin蛋白和mRNA表达。结果  与对照组比较，模型组大鼠体质量降低，出现大量蛋白尿，肾功能损害严重，伴低蛋白血症及高脂血症，血COR、U17-OHCS含量明显降低（P<0.01），病理显示肾小球出现硬化灶并缩小，部分肾小管内可见蛋白管型，Nephrin、Podocin蛋白和mRNA表达明显降低（P<0.01）;与模型组比较，泼尼松组和淫羊藿苷组大鼠上述异常无明显改善，联合组低体质量、蛋白尿、肾功能及代谢异常明显改善，病理损伤改善，血COR、U17-OHCS含量明显升高（P<0.05，P<0.01），Nephrin、Podocin蛋白和mRNA相对表达量明显升高（P<0.05）。结论  淫羊藿苷可改善FSGS模型大鼠对泼尼松的抵抗性，其机制可能与保护足细胞相关。

关键词：局灶节段性肾小球硬化;泼尼松;淫羊藿苷;大鼠

中图分类号：R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）11-0046-06

Abstract： Objective To observe the effects of icariin on prednisone resistance in rat models with focal segmental glomerulosclerosis （FSGS）; To explore its possible mechanism of action. Methods Totally 48 Wistar male rats were randomly divided into control group （10） and modeling group （38）. FSGS models were prepared by injection of doxorubicin （6.0 mg/kg） into the tail vein of rats. Rat urine protein >100 mg/24 h and 2 randomly selected rats were taken for renal histopathology as FSGS for successful modeling. The remaining 36 rats were randomly divided into model group （10）， prednisone group （10）， icariin group （8）， and prednisone combined with icariin group （joint group， 8）. Relevant medicine was given for gavage for 6 weeks. The rats were weighted， and 24 h urinary protein （24 h-UTP）， urea nitrogen （BUN）， creatinine （SCr）， total protein （TP）， albumin （ALB）， cholesterol （CHOL）， triglyceride （TG）， cortisol （COR）， and 17-hydroxycortisol （U17-OHCS） were detected. The pathological changes of renal tissues were observed by HE staining and Masson staining. The expressions of Nephrin， Podocin protein and mRNA were detected by Western blot and RT-PCR， respectively. Results Compared with the control group， body mass of model groupdecreased; a large amount of proteinuria， severe renal function impairment， hypoproteinemia and hyperlipidemia occurred; COR and U17-OHCS decreased （P<0.01）; pathologically， glomerular sclerosis appeared and narrowed; protein tubular type was observed in some renal tubules; the expressions of Nephrin， Podocin protein and mRNA significantly decreased （P<0.01）. Compared with the model group， prednisone group and icariin group had no significant improvement on the above abnormalities. The joint group significantly improved low body weight， proteinuria， renal function and metabolic abnormalities; pathological damage was alleviated; the contents of COR and U17-OHCS significantly increased （P<0.05， P<0.01）; the relative expression levels of Nephrin and Podocin protein and mRNA significantly increased （P<0.05）. Conclusion Icariin can improve the resistance of prednisone in FSGS rats， and its mechanism may be related to the protection of podocytes.

Keywords： focal segmental glomerulosclerosis; prednisone; icariin; rats

局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis，FSGS）是激素抵抗型肾病综合征（steroid resistant nephrotic syndrome，SRNS）的主要病理类型[1-2]，足细胞损伤是FSGS的核心事件[3]，保护足细胞是治疗FSGS的关键[4]。中药具有保护足细胞的作用[5-7]。戴恩来[8]从中西医结合角度认为，脾肾阳虚是SRNS的普遍证型，温补脾肾不仅能改善患者的阳虚之证，同时能增加激素的敏感性。课题组前期临床观察验证了此假说[9-10]。淫羊藿为温阳补肾的常用药物，《本草纲目》言其“能益精气”，淫羊藿苷为淫羊藿的提取物，属黄酮醇苷类化合物，分子结构明确，具有免疫调节等作用[11]。本实验通过Wistar大鼠尾静脉注射阿霉素建立FSGS模型，观察淫羊藿苷是否有改善此模型对泼尼松抵抗性的作用，并探讨其可能的作用机制。

1  材料与方法

1.1  动物

Wistar雄性大鼠48只，SPF级，体质量（200±20）g，甘肃中医药大学科研实验中心提供，动物质量合格证号62001000000425，动物生产许可证号SCXK（甘）2015-0002。饲养于甘肃中医药大学SPF级动物实验室，实验前适应性喂养1周，自由摄食饮水。

1.2  药物

淫羊藿苷，陕西博林生物技术有限公司，批号BL20180511011;阿霉素，Solarbio，批号111C024，25 mg/支;泼尼松片，浙江仙琚制药股份有限公司，批号140146，5 mg/片。

1.3  主要试剂与仪器

GAPDH Polyclonal Antibody，ImmunoWay，批号YM3215;Anti-Nephrin抗体（EPR20993），Abcam，批号ab216341;Anti-NPHS2抗体，Abcam，批号ab50339;Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），ImmunoWay，批号RS0002;Goat Anti-Mouse IgG（H+L），ImmunoWay，批号RS0003;ECL化学发光显色液，Millpore，批号WBKL50100;Trizol试剂，批号D912840，上海翊圣生物科技有限公司;反转录试剂盒，批号H4901003，上海翊圣生物科技有限公司;荧光定量试剂盒，批号H3912030，上海翊圣生物科技有限公司。

1.4  分组和造模

大鼠按随机数字表法分为对照组（10只）和造模组（38只），尾静脉注射阿霉素（6.0 mg/kg）制作FSGS模型[12-13]，1周后检测大鼠尿蛋白>100 mg/24 h提示模型复制成功[14]，为加以验证，随机选取2只造模大鼠取肾组织病理为FSGS。造模组其余36只大鼠随机分为模型组（10只）、泼尼松组（10只）、淫羊藿苷组（8只）、泼尼松联合淫羊藿苷组（联合组，8只）。

1.5  干预

泼尼松组按6.3 mg/（kg·d）泼尼松配制溶液灌胃，淫羊藿苷组按50 mg/（kg·d）[15]淫羊藿苷配制溶液灌胃，联合组按上述剂量泼尼松加淫羊藿苷配制溶液灌胃，对照组和模型组给予等体积饮用水灌胃。给药体积均为1 mL/100 g，连续6周。麻醉状态下体外心脏采血并取肾组织行相关检测。

1.6  指标检测

1.6.1  一般指标

药物干预期间每2周测体质量1次，并收集24 h尿液1次，记录尿量，3000 r/min离心5 min，无菌管收集尿液上清液，全自动生化分析仪免疫比浊法检测24 h尿蛋白（24 h-UTP），末次尿液测17-羟皮质醇（U17-OHCS）。体外心脏采血后静置1 h，3000 r/min离心10 min，收集上清液，全自动生化分析仪检测尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、胆固醇（CHOL）、三酰甘油（TG）、皮质醇（COR）。

1.6.2  肾组织病理形态观察

将大鼠左侧肾脏切除，生理盐水清洗，剥离肾包膜，将肾脏上、下极切成0.5 cm厚的组织，装入5 mL EP管中，加入4%组织细胞固定液，常温固定48 h。常规HE和Masson染色，镜下观察，并利用Image J软件采集图像。

1.6.3  Western blot检测肾组织Nephrin、Podocin蛋白表达

摘取大鼠右肾，去掉肾脏包膜后沿冠状面剖开，然后纵向切开，分装于2 mL冻存管中，编码标记，立即投入液氮罐中，然后置于-80 ℃冰箱保存。取肾组织，各组称100 mg肾脏组织，剪成碎片，置于5 mL EP管中，每20 g组织加200 μL RIPA组织细胞裂解液，电动匀浆，取出裂解液，4 ℃、13 000 r/min离心5 min，取上清液，用紫外分光光度计测定蛋白浓度，BCA定量蛋白浓度，调整蛋白浓度至一致，每30 μL蛋白樣品加10 μL上样缓冲液，震荡混匀后置于金属水浴锅98 ℃加热5 min，即得到蛋白裂解液。按照十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳的步骤操作，用封闭液稀释GAPDH抗体（1∶5000）、Nephrin抗体（1∶1000）、Podocin抗体（1∶500），使用Image J软件计算各条带的密度值，以GAPDH作为内参，计算目的蛋白与内参GAPDH条带的比值，进行分析。

1.6.4  实时荧光定量PCR检测Nephrin、Podocin mRNA表达

引物序列由宝日医生物技术有限公司合成。Nephrin：上游5-GCCCAATACACACAGAACGTC-3，下游5-CATTCATACTCTGCGTCATCA-3，扩增产物长度203 bp;Podocin：上游5-CGACCAGAGGAAGGG ATCA-3，下游5-TGGCTTTGGACACATGAGCTA-3，扩增产物长度378 bp;β-actin：上游5-GTTGTCCCT GTATGCCTCTG-3，下游5-GGAGCCAGGGCAGTA ATCT-3，扩增产物长度548 bp。用Trizol提取肾组织中总RNA，用反转录试剂盒反转录为cDNA，以其为模板进行PCR扩增，用荧光定量试剂盒进行反应，条件：95 ℃预热7 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40个循环，反应结束后制备融解曲线，以β-actin作为内参，用2-??Ct法计算Nephrin、Podocin mRNA相对表达量。

1.7  统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以±s表示，采用完全随机设计多样本方差分析，进行正态检验和方差齐性检验，符合正态要求用方差分析;方差齐时两两比较用LSD法或SNK法，数据不符合方差齐性采用Grames-Howell法进行两两比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1  一般状况

实验大鼠造模后精神状态日渐萎靡，饮食减少，大便稀。药物干预后，对照组大鼠体质量增加，精神状态、体毛保持良好，对周围环境敏感，模型组大鼠体毛发暗、反应迟钝、弓背蜷缩、大便稀溏，垫料湿且伴有明显骚臭味，体形偏瘦;与模型组比较，泼尼松组和淫羊藿苷组改善不明显，联合组明显改善，体毛较光滑，垫料较干，且体形较丰满，警觉性较强。模型组大鼠体质量明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.01），泼尼松组、淫羊藿苷组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05），联合组大鼠干预4、6周时体质量高于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表1。

2.2  泼尼松联合淫羊藿苷对模型大鼠24 h尿蛋白的影响

对照组大鼠尿蛋白量无明显变化，造模组大鼠24 h-UTP均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）;干预2周时，泼尼松组大鼠24 h-UTP明显低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），其余时间点泼尼松组、淫羊藿苷组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）;联合组大鼠24 h-UTP随干预时间的增加逐渐降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。结果见表2。

2.3  泼尼松联合淫羊藿苷对模型大鼠肾功能、血蛋白、血脂的影响

与对照组比较，模型组大鼠BUN、SCr、CHOL、TG均明显升高，TP、ALB明显降低（P<0.01）;与模型组比较，泼尼松组大鼠BUN、SCr、CHOL、TG无明显变化（P>0.05），TP、ALB明显降低（P<0.05），淫羊藿苷组大鼠BUN、SCr、TP、ALB无明显变化（P>0.05），CHOL、TG明显降低（P<0.01），联合组大鼠BUN、SCr、CHOL、TG明显降低，TP、ALB明显升高（P<0.01）。结果见表3。

2.4  泼尼松联合淫羊藿苷对模型大鼠肾阳虚指标血皮质醇、尿17-羟皮质醇含量的影响

模型组大鼠血COR、U17-OHCS含量明显低于对照组（P<0.01）;与模型组比较，泼尼松组大鼠血COR、U17-OHCS含量明显降低（P<0.01），淫羊藿苷组大鼠血COR含量明显增加（P<0.01），U17-OHCS无明显变化（P>0.05），联合组大鼠血COR、U17-OHCS含量明显增加（P<0.05，P<0.01）。结果见表4。

2.5  病理变化

对照组大鼠肾小球和肾小管结构正常;模型组、泼尼松组、淫羊藿苷组大鼠肾小球发生硬化缩小，肾小囊腔扩大，部分肾小管内可见蛋白管型;联合组大鼠病理损伤较模型组明显改善，仍有系膜增生，结构紊乱，肾小囊腔粘连等病理改变。结果见图1、图2。

2.6  泼尼松联合淫羊藿苷对模型大鼠肾组织Nephrin、Podocin蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠肾组织Nephrin、Podocin蛋白表达明显降低（P<0.01）;與模型组比较，泼尼松组大鼠肾组织Nephrin、Podocin蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），淫羊藿苷组大鼠肾组织Nephrin蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），Podocin蛋白表达明显降低（P<0.05），联合组大鼠肾组织Nephrin、Podocin蛋白明显升高（P<0.01）。结果见图3。

2.7  泼尼松联合淫羊藿苷对模型大鼠肾组织Nephrin、Podocin mRNA表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠肾组织Nephrin、Podocin mRNA表达明显降低（P<0.01）;与模型组比较，泼尼松组、淫羊藿苷组大鼠肾组织Nephrin、Podocin mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05），联合组大鼠肾组织Nephrin、Podocin mRNA表达明显升高（P<0.05）。结果见表5。

3  讨论

临床上FSGS多对糖皮质激素抵抗，成为SRNS的常见病理类型。本实验中，泼尼松组给予泼尼松6周后大鼠24 h-UTP、BUN、SCr及病理结果与模型组无显著差异，表明实验大鼠FSGS同样对泼尼松抵抗，与临床现象一致。

FSGS出现激素抵抗后治疗颇受关注。戴恩来[8]根据临床实际经验结合中医理论认为温阳法能改善糖皮质激素抵抗，提高疗效。本研究选用温阳补肾中药淫羊藿的主要成分淫羊藿苷联合泼尼松治疗，发现模型大鼠24 h-UTP、BUN、SCr及病理结果明显改善，表明淫羊藿苷可减轻FSGS大鼠对泼尼松抵抗，改善大鼠肾功能。

激素抵抗原因众多，包括基因突变[16]、糖皮质激素受体水平降低或亚型比例失调[17]、糖皮质激素转运的伴侣分子HSP90表达异常[18]及足细胞损伤等[19]，有研究发现，足细胞损伤越重，激素抵抗性越重[20]。Nephrin、Podocin是肾小球滤过膜上裂孔隔膜的重要组成蛋白，连接相邻足细胞的足突，由足细胞产生，是足细胞损伤的标志蛋白。本实验模型组大鼠肾组织Nephrin、Podocin及mRNA相对表达量明显降低，说明阿霉素致FSGS形成是足细胞损伤的过程，泼尼松组、淫羊藿苷組无明显疗效，Nephrin、Podocin蛋白和mRNA表达亦无明显上调，而联合组24 h-UTP、BUN、SCr及病理结果明显改善的同时，Nephrin、Podocin及mRNA相对表达量也明显上调，表明联合组疗效与保护足细胞有关。

证的本质研究有助于阐明中医治病的具体机制。沈自尹等[21]认为，体内下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴是肾阳的物质基础，COR是肾上腺分泌的内源性皮质醇，U17-OHCS是其代谢产物，是肾阳虚的常见指标[22]，降低意味着HPA轴功能减退，肾阳不足。本实验中模型组血COR、U17-OHCS含量降低，与文献中阿霉素所致肾病为肾阳虚证的结论[23-24]相一致，泼尼松组经泼尼松干预后血COR、U17-OHCS含量更低，其原因是泼尼松反馈性抑制HPA轴，国内应用此原理以泼尼松制作肾阳虚模型验证了这一观点。肾阳虚是中医对机体一种功能状态的概括，主要包括畏寒肢冷、完谷不化、性欲减低、神情淡漠等，在各种亚健康、慢性病中常见，药证相对，应用温补肾阳药物有改善作用，随着证的转机有助于病的好转，淫羊藿苷组单纯应用淫羊藿苷，血COR上调，进一步表明淫羊藿苷温肾阳的作用，但淫羊藿苷组肾功能未见好转，说明淫羊藿苷未能控制病情，联合组泼尼松和淫羊藿苷联合应用，肾阳虚好转，病情缓解，起到减毒增效作用。中药在整体层面调节机体内环境，为西药精准治疗创造了有利环境，联合应用，证与病同治，相得益彰。

本实验结果表明，温阳法可改善模型大鼠对泼尼松的抵抗性，其机制可能与保护足细胞相关。糖皮质激素抵抗的机制复杂，改善其抵抗性的原理有必要进一步研究，对泼尼松联合淫羊藿苷的量效关系有必要进一步探索。本实验中药物干预6周，临床上对人的激素抵抗以12周无疗效为标准，今后研究需探讨是否进一步延长FSGS大鼠的干预时间。

参考文献：

[1] 陈春梅，夏运成.成人原发性肾病综合征病理类型与激素疗效的关系[J].广东医学，2015，36（7）：1040-1042.

[2] 陈春梅，夏运成.成人原发性肾病综合征激素疗效差异的相关因素[J].中南大学学报（医学版），2015，40（1）：78-82.

[3] BARISONI L， SCHNAPER H W， KOPP J B. A proposed taxonomy for the podocytopathies：a reassessment of the primary nephrotic diseases[J]. Clin J Am Soc Nephrol，2007，2（3）：529-542.

[4] MALLIPATTU S K， HE J C. Podocyte as a direct target for treatment of glomerular disease[J]. Am J Physiol Renal Physiol，2016，311（1）：184- 201.

[5] 贺良平，熊国良，曾又佳.丹参酮ⅡA对嘌呤霉素诱导肾足细胞损伤的保护作用[J].中国中西医结合肾病杂志，2016，17（3）：221-223.

[6] LIU H， SUN W， GU L B， et al. Huaiqihuang Granules reduce proteinuria by enhancing nephrin expression and regulating necrosis factor κB signaling pathway in adriamycin-induced nephropathy[J]. Chinese Journal of Integrative Medicine，2017， 23（4）：279-287.

[7] 杨丽平，刘咏梅，占永立，等.益气清热膏通过内质网应激途径保护氨基核苷嘌呤霉素大鼠模型足细胞损伤的机制研究[J].中国中西医结合肾病杂志，2016，17（8）：667-671.

[8] 戴恩来.谈温阳法对激素的增敏作用[J].甘肃中医学院学报，2015， 32（4）：85-86.

[9] 戴恩来，卫建辉，贾宝岗，等.右归丸对激素抵抗型肾病综合征增敏作用及免疫功能的影响[J].中医研究，2015，28（2）：13-16.

[10] 戴恩来，施云剑，王蕾，等.右归丸对激素抵抗型肾病综合征的增敏作用及对其耐药基因的影响[J].中国中西医结合肾病杂志，2014，15（12）：1052-1055.

[11] 纪昕.淫羊藿苷免疫调节作用的研究进展[J].河北医药，2016，38（5）：753-756.

[12] 蔺建军，杨勇，高娜，等.阿霉素注射次数及剂量对肾病综合征模型的影响[J].中国中西医结合肾病杂志，2011，12（8）：676-678.

[13] 王竹，刘俊田，孙万森，等.祛风通络方对阿霉素肾病大鼠足细胞Desmin 及 CD2AP 蛋白的影响[J].中国中西医结合杂志，2014，34（2）：203-208.

[14] 杨维娜，于琳华，郭尚温，等.改良阿霉素肾病大鼠模型的建立[J].西安交通大学学报，2009，30（4）：446-452.

[15] 武密山，赵素芝，任立中，等.淫羊藿苷对去卵巢大鼠骨和下丘脑不同核团ERβ mRNA 表达的影响[J].中国药理学通报，2011，27（1）：29-33.

[16] ZHAO X， HWANG D Y ， KAO H Y. The role of glucocorticoid receptors in podocytes and nephrotic syndrome[J]. Nuclear Receptor Research，2018，5.DOI：10.11131/2018/101323.

[17] 謝华，林洪丽，陈吉林，等.原发性肾病综合征患者足细胞中糖皮质激素受体α和β的表达与激素敏感性的相关分析[J].中国现代医学杂志， 2012，22（36）：35-39.

[18] 欧阳涓，姜傥，谭敏，等.HSP 90在原发性肾病综合征发生和治疗中的意义[J].中山大学学报（医学科学版），2006，27（6）：661-666.

[19] ZHOU H， TIAN X， TUFRO A， et al. Loss of the podocyte glucocorticoid receptor exacerbates proteinuria after injury[J]. Scientific Reports，2017，7（1）：9833.

[20] 张波，刘志红，陈朝红，等.局灶节段性肾小球硬化患者足细胞病变的临床病理特征[J].肾脏病与透析肾移植杂志，2004，23（1）：1-6.

[21] 沈自尹，黄建华.从淫羊藿激活内源性干细胞探讨“肾藏精”的科学涵义[J].中医杂志，2010，51（1）：8-10.

[22] 张子怡，陈宝军，张庆，等.肾阳虚证动物模型的造模方法与评价指标[J].福建中医药，2014，45（2）：61-63.

[23] 赵彧，杜志仙.阿霉素致肾阳虚水肿模型大鼠三种实验方法的对比研究[J].山东中医杂志，2011，30（3）：190-193.

[24] 鲁艳芳，黄琼霞，袁军，等.阿霉素肾病模型与中医阳虚关系的探讨[J].中国中医药科技，2004，11（5）：259-260.

（收稿日期：2019-04-19）

（修回日期：2019-05-21;编辑：华强）