基于ISSR分子标记对黑河流域中下游黑果枸杞16个居群的遗传多样性分析

林丽 张敏 杜争 朱田田

摘要：目的  研究黑河流域中下游黑果枸杞16个野生居群的遗传多样性，为黑果枸杞的遗传育种及保护机制研究提供依据。方法  在建立ISSR分子标记的基础上，人工读带确定引物位点，利用Popgen32软件分析黑果枸杞的多态性、遗传相似系数及遗传距离。使用NTSYS软件建立黑果枸杞的遗传距离聚类图。结果  采用6个ISSR引物对16个黑果枸杞居群的基因组DNA进行扩增后共检测到126个位点，多态位点百分率为92.86%，不同居群间的多态位点百分率范围为6.35%～50.00%。Neis基因多样性指数H为0.222 8，Shannon信息指数I为0.345 9，分析得出居群间的变异为41.85%。聚类的遗传距离介于0.03～0.16，大体聚为2类。结论  黑河流域中下游黑果枸杞在种群水平上遗传多样性丰富，对环境的适应能力较强;黑果枸杞有复杂的遗传背景，且与地理来源相关性不强。

关键词：黑果枸杞;ISSR分子标记;遗传多样性

中图分类号：R282.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）11-0062-06

Abstract： Objective To study the genetic diversity of 16 wild populations of Lycium ruthenicum Murr.; To provide a theoretical basis for genetic breeding and establishment of protective mechanisms of Lycium ruthenicum Murr.. Methods Based on the establishment of ISSR molecular markers， the artificial reading bands were used to identify the primer sites. The polymorphisms， genetic similarity coefficients and genetic distances of Lycium ruthenicum Murr. were analyzed using Popgen32 software. NTSYS software was used to establish a genetic distance clustering map of Lycium ruthenicum Murr.. Results Totally 6 ISSR primers were used to amplify the genomic DNA of 16 populations and a total of 126 sites were detected. The percentage of polymorphic sites was 92.86%. The percentage of polymorphic sites among different populations was in the range of 6.35%–50.00%. The Neis gene diversity index H was 0.222 8 and Shannons information index I was 0.345 9. The analysis showed that the variation among populations was 41.85%. The genetic distance of clustering was in the range of 0.03–0.16， which could roughly be divided into two categories. Conclusion The genetic diversity of Lycium ruthenicum Murr. in middle and lower reaches of Heihe River basin is abundant at the population level， and has a strong adaptability to the environment. Lycium ruthenicum Murr. has a complex genetic background and is not strongly related to geographical origin.

Keywords： Lycium ruthenicum Murr.; ISSR molecular markers; genetic diversity

黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.為茄科枸杞属植物，主要分布于宁夏、甘肃、青海、新疆、内蒙古等地[1]。黑果枸杞药用部位为果实，味甘、性平，用于治疗腰膝酸软、心脏病等。药理研究表明，黑果枸杞具有增强免疫力、抗焦虑、预防癌症、延缓衰老作用[2-5]。黑果枸杞不仅可药食两用，且抗盐、耐旱及根系发达等特征使其适宜在干旱、半干旱地区种植，改善生态环境，因此，黑果枸杞药用价值、生态价值和经济价值兼具[6-8]。目前黑果枸杞野生资源大于栽培资源，但产量低且采摘困难，市场供不应求，野生居群分布地区逐渐减少，资源开发与利用均十分困难。

DNA分子标记技术是基于DNA技术的分子标记体系，可反映生物个体或种群之间的差异性DNA片段，相对于传统的形态标记和生化标记，具有稳定、精确、简便等优点。基于SSR技术的ISSR分子标记技术是其中应用最为广泛的一种，以其方便、快捷、成本较低的优势，目前已广泛应用于各种植物的遗传多样性研究[9-14]。本研究根据黑果枸杞不同地理分布区，以16个种群黑果枸杞为材料，应用ISSR分子标记技术，依据群体遗传学原理，进行黑果枸杞遗传多样性研究，分析黑果枸杞居群的遗传规律，探明其濒危遗传机制，为其种质资源鉴定、遗传保护及栽培繁育等提供依据。

1  仪器与试药

PCR扩增仪，德国Biometra;TGL16M型台式高速冷冻离心机，湖南凯达科学仪器有限公司;Gel Doc XRTM紫外光凝胶成像系统，美国Bio-Rad;DYY-7型轉移电泳仪、Biophotometer Plus蛋白核酸定量测定仪，德国Eppendorf公司。

无病虫害的黑果枸杞新鲜幼嫩叶片，放入硅胶中干燥保存[15]，样品由甘肃中医药大学晋玲教授鉴定为黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.，样品采集信息见表1。植物DNA提取试剂盒，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;试验所用引物均由上海生物工程有限公司合成;PCR扩增所用试剂TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×Buffer及提取DNA所用RNA酶，天根生化科技有限公司;Agarose琼脂糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、Tris碱、石英砂、β-巯基乙醇、gold view核酸染料、EDTA、Marker，西安科昊生物工程有限责任公司。

2  方法

2.1  DNA提取与检测

参照文献[15-16]方法适当改良，提取黑果枸杞叶片DNA，配制琼脂糖凝胶，浓度为0.8%，电泳成像后观察提取的DNA是否清晰明亮、有无杂带、扩散条带是否完整等。将提取的DNA装入1.5 mL管中，置于-20 ℃冰箱保存备用。

2.2  PCR反应体系与扩增程序

参照加拿大哥伦比亚大学（UBC）提供的ISSR引物序列，对16个居群黑果枸杞叶片DNA进行ISSR扩增，最终选出扩增条带多、背景清晰的6条引物用于PCR扩增及后续处理，引物信息见表2。

根据正交试验得出的最优体系对黑果枸杞16个居群共319个样本进行PCR扩增。扩增体系共20 μL，其中DNA 1 μL、引物1 μL、10×PCR Bufffer 2.5 μL、Mg2+ 1.5 μL、dNTP 0.7 μL、Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，用dH2O补足，共补13.1 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s，退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min，共40个循环;72 ℃延伸7 min。置于4 ℃冰箱保存。

2.3  电泳检测

配制1.2%琼脂糖凝胶，置于盛有5×TBE缓冲液的电泳槽，120 V稳压电泳1.5 h，通过凝胶成像系统观察，拍照保存。

2.4  遗传多样性分析

采用Image Lab 3.0软件对所得图谱进行分析，每个条带代表1个引物的结合位点。电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，将有带和缺失分别赋予1和0，建立“0/1”矩阵，利用Popgen32软件对319个黑果枸杞样本扩增条带形成的“0/1”矩阵分析多态位点百分率（PPB）[17]、等位基因平均数Na、Neis基因多样性指数H、Shannon信息多样性指数I、有效等位基因Ne、Neis遗传相似系数和遗传距离。应用NTSYS软件建立黑果枸杞的UPGMA聚类树状图[18-19]，分析16个黑果枸杞野生居群间的亲缘关系。

3  结果与分析

3.1  PCR扩增结果

对16个居群的319个黑果枸杞样品DNA扩增，得到的条带整体明亮且完整清晰，见图1～图4。

3.2  居群遗传多样性分析

采用6个ISSR引物对16个黑果枸杞居群的基因组DNA进行扩增，共检测到126个位点。6个引物扩增的条带数为15～30条，条带扩增最多的是引物UBC-881（30条），最少的是引物UBC-876（15条），平均每个引物的大小介于200～1900 bp;其中117条具有多态性，计算得到多态位点百分率（PPB）为92.86%。16个黑果枸杞种质材料的等位基因平均数Na、有效等位基因Ne、Neis基因多样性指数H和Shannon信息指数I分别为1.928 6、1.376 4、0.222 8和0.345 9，标准差分别为0.258 6、0.377 4、0.188 7和0.252 9。不同居群内的PPB介于6.35%～50.00%，Neis基因多样性指数范围为0.021 2～0.182 3，Shannon信息指数范围为0.032 1～0.262 8，见表3。可见，16个居群的黑果枸杞具有较高的多态性，变异潜能大，进一步说明其具有复杂的遗传背景。此外，由于各居群的PPB、Nei's基因多样性指数和Shannon信息指数明显低于种群间的多态位点百分率，说明黑果枸杞居群内的遗传多样性水平低于居群间。

3.3  居群间遗传分化分析

通过Popgen32软件分析得到319份黑果枸杞样本居群间的遗传多样性Ht为0.222 6，居群内遗传多样性Hs为0.129 4，根据Ht和Hs计算居群间遗传分化系数Gst为0.418 5。分析得出居群间的变异为41.85%，而居群内的变异为58.15%，即居群内的变异占总变异比例较大。当基因流Nm>1时，居群间的基因值越大则基因交流越强[20]。本研究采用Popgen32软件处理得到的Nm值为0.694 8，表明所研究的黑果枸杞居群间基因交流可能为0。

3.4  遗传距离和遗传相似性

利用Popgen32软件对319个黑果枸杞DNA条带组成的“0/1”矩阵进行遗传距离和遗传相似性分析，结果见表4。16个黑果枸杞居群的遗传距离为0.033～0.255 3，平均0.121 8，遗传距离最大的3号居群和16号居群为0.255 3，遗传距离最小的1号居群和2号居群为0.033 0，说明不同黑果枸杞居群之间存在较高的遗传多样性。16个群的遗传相似系数介于0.774 7～0.967 5。遗传相似系数最小的3号居群和16号居群为0.774 7，说明这2个居群亲缘关较远;遗传相似系数最大的1号居群和2号居群为0.967 5，说明这2个居群亲缘关最近。

3.5  聚类分析

应用NTSYS软件建立黑果枸杞16个居群的Neis遗传距离UPGMA聚类图（见图5）。聚类的遗传距离为0.03～0.16。在遗传距离为0.16时，16个居群中的1、2、6、7、8、9、10、11、12、13、14号的黑果枸杞居群聚为第Ⅰ类，15、16号的黑果枸杞居群聚为第Ⅱ类。在遗传距离为0.125附近，1、2、4、5号的黑果枸杞居群聚为第Ⅲ类，6、7、8、9、10、11、12、13、14号的黑果枸杞居群聚为第Ⅳ类。在遗传距离为0.12附近，5、6号的黑果枸杞居群聚为第Ⅴ类，8、9、10、11、12、13和14号的黑果枸杞居群聚为第Ⅵ类。在遗传距离为0.10时，7、8、9、10、14号的黑果枸杞野生居群聚为第Ⅶ类，12、13号的黑果枸杞居群聚为第Ⅷ类。在遗传距离为0.085时，5、6号的黑果枸杞居群聚为第Ⅷ类，7号的黑果枸杞野生居群聚为第Ⅸ类。在遗传距离为0.075时，1、2号的黑果枸杞居群聚为第Ⅸ类。3、4、5号的黑果枸杞居群聚为第Ⅹ类。在遗传距离为0.07时，12、13号的黑果枸杞居群聚为第Ⅺ类。

4  讨论

遗传多样性能够反映一个物种的起源与进化、繁殖活力和环境变化适应力，在很大意义上决定了物种的数量、地理分布及未来的生存和发展，还可指导遗传资源基因保护、鉴定和栽培繁育种质资源，遗传多样性是人类赖以生存的基础。由于黑果枸杞的分布生境大多比较脆弱，加之药用部位为浆果，采摘困难，产量不高，而目前市场供不应求，野生分布逐渐减少，生态环境也逐渐恶化。现阶段对黑果枸杞的遗传多样性研究报道较少，且局限于新疆产的黑果枸杞[21]，而对其他主产区黑果枸杞未见报道。本研究对15个甘肃黑果枸杞居群和1个内蒙额济纳旗黑果枸杞居群的遗传多样性进行研究，通过小数量的遗传资源，尽可能反映整个黑果枸杞野生群体的多样性。本研究对筛选优质、高产的优良品种，指导黑果枸杞产业发展，建设引种栽培和种植基地，合理规划开采野生资源，保证资源的持续利用等有很大的现实意义。

本研究运用分子标记的方法对选定黑果枸杞群体进行扩增，用Popgen32软件分析黑果枸杞16个野生居群，共检测到126个位点，其中117条具有多态性，PPB为92.86%，而各居群的PPB均低于该值，说明有些位点分布不均匀，只在少数种群中能检验出多态性。另外，高臺县南华镇墩仁村的黑果枸杞PPB仅为6.35%，可能有2个原因：一是采样地点比较孤立，地理位置的局限性导致其遗传多样性较低;二是试验处理中的误差可能导致该值偏小。16个黑果枸杞种质材料的等位基因平均数为1.928 6，有效等位基因为1.376 4，Neis基因多样性指数为0.222 8，Shannon信息指数为0.345 9，而后两者变化趋势大体一致。16个居群的黑果枸杞多态性高，变异潜能大，进一步说明其有复杂的遗传背景。此外，由于各种群的PPB、Neis基因多样性指数和Shannon信息指数明显低于种群间的多态位点比率，说明黑果枸杞居群内的遗传多样性水平低于居群间。16个黑果枸杞居群的遗传距离介于0.033 0～0.255 3，说明不同黑果枸杞居群之间遗传多样性水平较高。遗传相似系数介于0.774 7～0.967 5。可以看出，遗传距离与遗传相似系数成反比，遗传相似系数和遗传距离反映遗传分化程度，进而反映其物种存在的久远性。聚类的遗传距离为0.03～0.16，总共被聚为11类，其中甘州区海潮坝、甘州区靖安乡上堡村四社的黑果枸杞居群遗传距离最近，在0.03处就被聚为一类，说明这2个居群的亲缘关系近。从整体上看，各居群在遗传距离与地理距离的关系上并没有很强的相关性。

一般而言，所选取的样本越大，涉及的地理范围越广，试验结果的可靠性就越大。本研究选取的样本数较多，基本涵盖了黑果枸杞在甘肃境内的自然分布区域，结果较为可靠。

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（收稿日期：2018-08-27）

（修回日期：2019-04-02;编辑：陈静）