灯盏花素改善胰岛素抵抗作用机制网络药理学分析

闫方艳 李锦平 武莉 冯吉波

摘要：目的  基于网络药理学方法，探讨灯盏花素和胰岛素抵抗相关靶点之间的相互作用及其作用机制。方法  通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）结合文献挖掘确定灯盏花素的主要活性成分，多个数据库联用检索和筛选活性成分对应靶点，构建活性成分-靶点-疾病网络，并通过SystemsDock web site对其进行对接验证，利用DAVID数据库对靶点生物功能及相关通路进行关联分析。结果  经数据库检索及文献查证，灯盏花素主要活性成分为灯盏乙素，网络拓扑分析筛选出与胰岛素抵抗治疗密切相关的潜在关键靶点4个（NOS3、PTPN1、ADORA1、PRKCG），参与代谢调控、炎症反应和有机氮化合物代谢等生物过程，通过干预PI3K-Akt、Ras、Insulin resistance和HIF-1等相关通路发挥抗胰岛素抵抗作用。结论  灯盏花素可能通过多靶点、多途径发挥改善胰岛素抵抗的作用，为深入开展其作用机制研究提供依据。

关键词：网络药理学;灯盏花素;胰岛素抵抗;作用机制;分子对接

中图分类号：R259.87;R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）11-0085-05

Abstract： Objective To probe into the interaction between breviscapine and targets associated with insulin resistance and its mechanism based on network pharmacology. Methods The main active components of breviscapine were determined by TCMSP databases and literature mining. Multiple databases were used to search and screen the corresponding targets of active components. The active components-target-disease network was constructed and its docking verification was conducted through the SystemsDock web site. The targets biological functions and related pathways were analyzed by DAVID. Results Verified by the database retrieval and literature， scutellarin was reported to be the main active component of breviscapine. Network topology analysis identified four potential key targets closely related to insulin resistance therapy （including NOS3， PTPN1， ADORA1， and PRKCG）， participating in biological processes such as metabolic regulation， inflammatory reaction， metabolism of organic nitrogen compounds. Anti-insulin resistance was exerted by intervention of related signaling pathways such as PI3K-Akt， Ras， insulin resistance and HIF-1. Conclusion Breviscapine may improve the role of insulin resistance through multiple targets and pathways， which can provide a scientific basis for further research on its mechanism.

Keywords： network pharmacology; breviscapine; insulin resistance; mechanism; molecular docking

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是指组织器官或组织细胞对胰岛素的生物调节作用不敏感或无反应而导致正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态，是心血管疾病相关的糖尿病、冠心病、肥胖、高脂血症等代谢性疾病的共同核心关键因素[1-2]，改善IR对心血管疾病的防治具有极其重要的意义。IR发病机制复杂，涉及多种因素的相互作用、相互影响且大多具有多基因相关性，使用单一靶点的药物无法实现对IR的有效控制，由此，进行网络药理学研究具有重要意义[3-6]。

灯盏花素（breviscapine）是灯盏花经醇提后的总黄酮成分，具有抗氧化、抗血栓、保护脑组织等广泛的药理作用，临床用于脑血栓、心绞痛、动脉硬化等缺血性心脑血管疾病及糖尿病的治疗[7]，已有研究表明，灯盏花素能调节糖脂代谢紊乱，增强胰岛素敏感性，对IR有一定疗效[8-9]，但其具体药效物质基础和作用机制尚不明确。鉴于IR发生机制的复杂性及灯盏花素作用的广泛性，推测灯盏花素的作用具有多靶点可能性，为进一步探讨灯盏花素改善IR的分子机制，本研究运用网络药理学方法，借助靶点预测、分子对接等技术，通过构建灯盏花素活性成分与IR相关靶点之间的多层次作用网络，结合其改善疾病的主要通路，在网络调控的层面综合分析灯盏花素改善IR的作用机制，为后续实验验证奠定基础，并为临床用药提供依据。

1  资料与方法

1.1  药物活性成分确定及潜在靶点筛选

检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）、中药化学成分数据库（http：//cowork.cintcm.com/engine/ search？channelid=58730），获取已报道的灯盏花素化学成分，进一步查阅相关文献，确定灯盏花素主要活性成分。

经TCMSP获取活性分子的毒药物动力学（ADME）性质，即对其口服生物利用度（OB）、类药性（DL）进行评估（OB≥2.64%、DL≥0.79），利用Pubchem数据库（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）结合文献挖掘对分子结构进行确证。

采用反向药效团对接（PharmMapper，http：//59.78.96.61/pharmmapper/）、药物相似性搜索（STITCH，http：//stitch.embl.de/）、GeneCards（https：// www.genecards.org/）数据库预测和筛选活性分子对应靶点，去除重复和假阳性靶点基因，得到灯盏花素改善IR的潜在靶点数据集。

1.2  疾病靶点筛选

通过Cytoscape3.6.1软件的DisGeNET插件搜索与IR相关的靶点基因，其数据来源包括人类基因和基因表型综合数据库（OMIM）、国际遗传药理学数据库（PharmGkb）、毒性与基因比较数据库（CTD，http：//ctdbase.org/）等多个数据库，可靠性较高[10]。利用GeneCards数据库及文献资料进行筛选验证，去除重复数据，得到IR相关靶点数据集。

1.3  网络构建与分析

将上述得到的不规范的靶点名称通过UniProt数据库（http：//www.uniprot.org/）整理靶点基因名，去掉重复项，用于后续分析。以药物活性成分、成分对应靶点、药物相关疾病、IR相关靶点四者为节点，建立对应关系，导入Cytoscape3.6.1软件，构建活性成分-靶点-疾病，网络并利用其插件Network Analyzer进行分析[11]，观察药物与疾病靶点的相互作用情况，以确定其潜在关键作用靶标。

1.4  分子对接验证

分子对接技术是确认分子与靶点有效作用的途径[12-13]，通过UniProt数据库获取所得潜在关键靶标X射线晶体结构的PDB编号，利用SystemsDock web site（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/ index）[14]对关键靶标与灯盏花素的活性成分进行分子对接验证，用以评价活性小分子与靶点之间的结合活性。

1.5  生物学过程和信号通路富集分析

将得到的活性分子靶点数据集导入DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）进行GO（gene ontology）生物学过程[15]和KEGG通路富集分析，再通过CTD数据库及相关文献查阅，以阈值P<0.05筛选整合排名靠前的生物学过程或通路。

2  结果

2.1  药物活性成分及靶点

通过TCMSP、Pubchem等数据库及文献挖掘确定灯盏花素主要成分为灯盏乙素（Scutellarin）和少量灯盏甲素，灯盏乙素是其主要活性单体，含量>95%，对其进行ADME计算发现，灯盏乙素的OB值较低，需要大剂量多次给药，提示在制剂开发中需要注意剂型选择问题。此外，由于本实验要求目标化合物须为中药中的活性成分，故对灯盏甲素不做深入研究。

基于预测软件及专业靶点数据库检索结合文献调研，去重后得到灯盏乙素潜在作用靶点121个，筛选验证后得到与灯盏花素改善IR可能的相关作用靶点42个，检索到与IR相关的靶点基因222个，最终匹配得到靶点数据集69个。

2.2  网络可视化分析

通过对所构建网络的分析，可得网络的一般特征及对药物治疗疾病作用机制的初步认识，进一步探索与药物、疾病相关的作用途径[11，16]。燈盏花素活性成分-靶点-疾病网络见图1。

该网络共包含121个节点和132条边线，网络密度（network density）、网络中心度（network centralization）、网络异质性（network heterogeneity）分别为0.017、0.567、3.823，不同颜色的节点分别代表药物活性成分、靶点和相关疾病，边线表示各节点之间的相互作用关系。通过网络拓扑分析，选择度和介数均大于平均值的靶点作为关键作用靶点（见表1），提示灯盏花素可能通过这些靶点具有潜在的改善IR的作用。

2.3  分子对接

将所得潜在关键靶点的PDB编号导入SystemsDock web site并与灯盏花素活性成分进行对接，结果见表2。此对接方法所得分数是实验解离/抑制常数值的负对数（pKd/pKi），通常为0～10（即从弱到强结合），允许直接指示结合强度。通常认为，对接打分>4.25说明分子与靶点之间有一定的结合活性，>5.0说明分子与靶点有较好的结合活性，>7.0说明分子与靶点具有强烈的结合活性[14，17]。对接结果显示，灯盏乙素与靶点的对接分数均介于5.0～7.0，表明灯盏花素活性成分与关键靶点具有较好的结合活性。另外，经文献查证，上述重要靶点在IR的发生发展过程中均存在直接或间接的关系，说明该研究方法具有一定的科学性。

2.4  主要生物学过程

使用DAVID数据库对灯盏花素的活性成分灯盏乙素对应靶点的生物功能进行分析，并以P<0.05筛选整合排名靠前的生物学过程，富集度较高的前20个生物学过程见表3。灯盏花素的靶点基因大多富集在细胞凋亡及分化的调节、代谢过程调控、对缺氧的反应、炎症反应过程、有机氮化合物代谢等过程中。

2.5  主要信号通路

通过DAVID数据库对灯盏乙素对应靶点进行KEGG信号通路富集分析，借助Omicshare云平台（http：//www.omicshare.com/）对排名靠前的通路进行整合绘制，按P值由小到大排列的前20条信号通路见图2。可以看出，根据P<0.05的要求，燈盏花素主要参与VEGF、HIF-1、PI3K-Akt、Ras等信号通路，涉及其他通路有花生四烯酸代谢、糖尿病并发症中的AGE-RAGE通路等，其中PI3K-Akt、Insulin resistance、Ras、HIF-1信号通路与IR的发生密切相关，这表明灯盏花素作用靶点分布于不同的代谢通路，相互协调、共同调节是其改善IR的可能作用机制。

3  讨论

本研究采用网络药理学方法构建了灯盏花素改善IR的活性成分-靶点-疾病网络，分析了药物成分、靶点与疾病之间的相互作用关系，并对活性分子与其潜在关键作用靶点进行了对接打分、GO生物学过程和KEGG通路富集分析。富集分析结果显示：灯盏花素通过调控细胞代谢、炎症反应等生物过程在细胞内细胞器等部位发挥离子/蛋白/信号受体结合、蛋白酪氨酸激酶活性激活等分子功能;富集所得通路中，PI3K-Akt、Ras、Insulin resistance等信号通路与IR的发生及治疗密切相关，此外还得到与癌症、细胞增殖与凋亡等相关的通路。

网络拓扑分析发现，NOS3、PTPN1、ADORA1、PRKCG在灯盏花素改善IR作用中起重要作用。研究表明，NOS3基因是IR发生的基因标志之一，药物通过PI3K途径增加内皮型一氧化氮合酶表达水平，调节胰岛素受体后信号分子的异常，从而减轻细胞等组织的IR[18];胰岛素信号传导负调节因子PTP1B编码基因PTPN1参与胰岛素信号传导通路的调控，其通过IRS1的酪氨酸残基去磷酸化作用干预PI3K-Akt信号通路，从而对胰岛素信号转导进行负调节[19-20];在Western diet高脂小鼠模型中发现，ADORA1缺失会加重非酒精性脂肪肝和IR，促进肥胖的产生[21]。由此可见，IR的发生发展与这些关键靶点可能存在直接或间接联系，而灯盏花素改善IR可能涉及多个过程和通路的协同作用，这与文献报道的灯盏花素具有广泛药理活性相一致。

上述研究结果尽管体现了灯盏花素多靶点、多通路改善IR的作用特点，但因目前有关灯盏花素改善IR作用机制研究报道较少，加之网络药理学有关疾病和药物数据库信息资源的局限性，使文献报道的实验数据可能与数据库实际收录信息存在偏差，随着科研不断深入及网络药理学的进步，与疾病治疗和药物作用相关的新靶点将不断被发现。此外，灯盏花素作为一类中药单体具有广泛的药理作用及临床应用，其作用靶点之间是否具有相似性还未可知，利用网络药理学方法进行研究，可预测药物可能的作用靶点及作用途径，较全面地进行作用机制分析，增强实验目的性，减少实验资源的消耗，为进一步开展灯盏花素改善IR的实验研究及临床新用途的研究与开发提供依据。

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（收稿日期：2018-12-16）

（修回日期：2019-02-12;编辑：陈静）