基于网络药理学的石菖蒲治疗注意缺陷多动障碍作用靶点及信号通路研究

冯锴 任昕昕 吴静静 于庆洋 黄靖涵 王俊宏

摘要：目的  采用网络药理学方法筛选石菖蒲治疗注意缺陷多动障碍（ADHD）的作用靶点及相关信号通路，进一步明确其作用机制。方法  通过中药系统药理数据库与分析平台（TCMSP）、TCM Database@Taiwan数据库检索石菖蒲化学成分并筛选作用靶点，从DisGeNET、ADHDgene、TTD及DrugBank数据库检索与ADHD相关的疾病靶点，利用Cytoscape3.2.1软件构建化合物-靶点网络，并筛选核心网络，进一步进行GO功能和KEGG通路富集分析。结果  共筛选出石菖蒲治疗ADHD的化合物65个，与之相对应的作用靶点25个。共涉及信号通路238条，按其生物功能富集分为7组，分别为腺苷酸环化酶-G蛋白偶联受体信号通路、磷脂酶C-G蛋白偶联受体信号通路、单胺类神经递质转运、腺苷酸环化酶活性的调节、胺类物质转运的调控、平滑肌收缩功能及血管活性调节。结论  本研究初步验证了石菖蒲治疗ADHD的药理学作用机制，为进一步从细胞生物学层面验证其作用机制奠定了基础。

关键词：石菖蒲;注意缺陷多动障碍;网络药理学;成分-靶点;信号通路;机制

中图分类号：R272.974.93;R285.5    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）11-0095-06

Abstract： Objective To screen the targets and related signaling pathways of Acori Tatarinowii Rhizoma for attention deficit hyperactivity disorder （ADHD） using network pharmacology; To further clarify its mechanism of action. Methods TCMSP and TCM Database@Taiwan were used to screen the active components of Acori Tatarinowii Rhizoma. Disease targets associated with ADHD were retrieved from DisGeNET， ADHDgene， TTD， and DrugBank database. The Cytoscape 3.2.1 software was used to construct a compound-target network and screen the core network. Further analysis of GO function and KEGG pathway enrichment was conducted. Results Totally 65 compounds in Acori Tatarinowii Rhizoma were screened out， and 25 corresponding targets were screened out. There were 238 signaling pathways involved in 7 signaling pathways， which were adenylate cyclase-activating G-protein coupled receptor signaling pathway， monoamine transport， phospholipase C-activating G-protein coupled receptor signaling pathway， regulation of adenylate cyclase activity， regulation of amine transport， regulation of tube diameter and smooth muscle contraction. Conclusion This study preliminarily verifies the pharmacological mechanism of Acori Tatarinowii Rhizoma in treating ADHD， and has laid a foundation for further verification of its mechanism from the cellular biological level.

Keywords： Acori Tatarinowii Rhizoma; attention deficit hyperactivity disorder; network pharmacology; component-target; signaling pathways; mechanism

注意缺陷多動障碍（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）是一种常见于儿童和青少年的神经精神发育障碍类疾病，可持续到成年，其三大临床核心症状为多动、注意力不集中、冲动。尽管目前的药物治疗，如兴奋剂和抗抑郁剂，能够改善ADHD的症状，但仍有约20%～40%的患者不能从中受益[1]。依据其临床特征，ADHD与中医学“躁动”“脏躁”“健忘”等证较为相似，临床医家多从阴阳失衡[2]、脏腑失调[3]、气阴两虚[4]等方面进行辨证论治，所用复方药味虽多，但必用开窍醒神药，其中以石菖蒲最为多见[5]。

石菖蒲首载于《神农本草经》，被列为上品，为天南星科多年生草本植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott的根状茎，其味辛、苦，性微温，入心、胃经，具有化湿和胃豁痰、开窍醒神益智的功效。石菖蒲可舒利心气以解郁宽中，开窍宁神，其清芬之性，走达诸窍而通之，使一身之气起亟旋展，临床广泛用于癫痫、多动症、阿尔茨海默病、抑郁症等神经精神类疾病的治疗[6]。现代药理学研究表明，石菖蒲不仅对中枢神经系统具有兴奋-抑制的双向调节作用，而且具有改善学习记忆、抗炎、调节免疫功能等多种药理作用[7-8]。然而其安神定志、醒脑开窍的具体作用机制尚不明确。

中药具有多成分、多靶点的特点，因此对中药的相关研究必须采取整合策略，以多学科间的交叉融合为基础，构建新的研究体系[9]。网络药理学是在网络生物学与多向药理学的基础上提出的药物设计思路[10]，其阐述的药物与疾病靶点之间相互联系，与中医整体观念等核心思想相一致。它强调了将生物学网络与药物作用网络整合，分析药物在网络中与节点或网络模块的关系，由寻找单一靶点转向综合网络分析，借助高通量技术、网络可视化技术及网络分析技术，构建出由药物与疾病基因之间复杂的交叉网络[11]。通过网络节点间的关系来分析网络特性，进一步阐明药物作用机制。本研究采用网络药理学的方法，进一步明确石菖蒲的有效成分及作用靶点，探讨其改善ADHD核心症状的作用机制。

1  资料与方法

1.1  药物化学成分收集与筛选

本研究以“石菖蒲”为关键词，通过中药系统药理数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/ tcmsp.php，V2.3）和TCM Database@Taiwan（http：//tcm. cmu.edu.tw/，更新至2014年3月25日）检索石菖蒲的所有化学成分及对应靶点[12]。

对所检出的石菖蒲化学成分进行筛选。筛选条件：口服生物利用度（OB）≥30%[12]，血脑屏障渗透度（BBB）≥-0.3[13]。其中，OB是药物吸收、分布、代谢、排泄（ADME）等特性研究中重要的药代动力学参数，较高的OB可减少用药量，同时在一定程度内减少药物不良反应的发生。此外，ADHD病因研究提示其多与脑内神经递质紊乱有关，对于治疗ADHD的药物而言，BBB是影响其生物利用度的另一个关键因素。因此，本研究选用OB和BBB作为筛选石菖蒲活性成分的指標。

1.2  疾病靶点筛选

通过DisGeNET（http：//www.disgenet.org，V5.0）、ADHDgene（http：//adhd.psych.ac.cn/，更新至2014年2月14日）、TTD（http：//bidd.nus.edu.sg/group/ttd/，更新至2017年9月12日）及DrugBank数据库（https：//www.drugbank.ca/，V5.1.0）检索与ADHD相关的基因。

1.3  药物与疾病关联靶点网络的构建

将筛选后的石菖蒲化学成分作用靶点及ADHD疾病靶点录入Cytoscape3.2.1软件。存在交集的蛋白质很有可能是石菖蒲活性成分治疗ADHD的靶点。由于靶点信息来源不统一，故使用Uniprot数据库（http：//www.uniprot.org/）对得到的靶点信息进行校正，获得人类相关靶点的Uniprot ID。采用Cytoscape3.2.1软件的Network Analysis插件，以平均自由度为标准，对石菖蒲治疗ADHD的化合物-靶点网络进行拓扑分析，筛选核心网络。

1.4  富集分析

利用Cytoscape3.2.1软件的ClueGO和CluePedia插件对筛选出的核心网络靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，探讨石菖蒲化学成分的靶点通过调控目标基因功能和信号通路改善ADHD核心症状的作用机制。

2  结果

2.1  药物活性成分

以OB≥30%、BBB≥-0.3作为筛选条件，共得到石菖蒲的活性化学成分63个。值得注意的是，elemicin和gamma-asarone两成分的OB<30%，但二者均为石菖蒲较为重要的活性成分[14-15]。因此，本研究共纳入65个石菖蒲活性成分（TCM Database@Taiwan数据库检索相关结果已涵盖在TCMSP数据库检索结果内），具体见表1。

2.2  药物与疾病的化合物-靶点网络

本研究通过比对从TCMSP数据库纳入的筛选后石菖蒲活性成分对应的靶点和从DisGeNET、ADHDgene、TTD及DrugBank数据库收集的ADHD疾病靶点，共得到石菖蒲-ADHD共同作用靶点25个。石菖蒲-ADHD的化合物-靶点网络见图1。

2.3  药物与疾病的化合物-靶点核心网络

采用Cytoscape3.2.1插件Network Analysis以平均自由度为标准对网络进行拓扑分析，共得到石菖蒲活性成分7个（8、13、32、37、46、47、51号）及相关治疗靶点21个，见表2。石菖蒲治疗ADHD的化合物-靶点-疾病核心网络见图2。

2.4  信号通路分析

本研究采用Cytoscape3.2.1软件的ClueGO和CluePedia插件对石菖蒲治疗ADHD的化合物-靶点-疾病核心网络中的靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，共发现信号通路238条（见图3）。按其生物功能富集分析结果分为7组，分别为腺苷酸环化酶-G蛋白偶联受体信号通路、磷脂酶C-G蛋白偶联受体信号通路、单胺类神经递质转运、腺苷酸环化酶活性的调节、胺类物质转运的调控、平滑肌收缩功能及血管活性调节。见图4。

3  讨论

为进一步探究石菖蒲改善ADHD核心症状的化合物及其作用的疾病靶点与信号通路之间的关系，本研究以OB和BBB为筛选条件，从TCMSP、TCM Database@Taiwan数据库筛选出石菖蒲的活性成分，从DisGeNET、ADHDgene、TTD及DrugBank数据库检索与ADHD相关的疾病靶点，两者映射比对后，以平均自由度为标准，确定了石菖蒲治疗ADHD的化合物-靶点核心网络，涉及信号通路238条。本研究筛选出的石菖蒲治疗ADHD的作用靶点已被证实参与了本病的发生发展过程[16]，包括单胺类神经递质、5-羟色胺、神经递质转运体、单胺氧化酶、乙酰胆碱等。富集分析表明，石菖蒲治疗ADHD的大多数潜在靶点与神经递质受体的活性和转运密切相关。G蛋白偶联受体（GPCR）是单胺类神经递质信号转导中不可或缺的介质，GPCR编码基因的突变被认为是ADHD发病的重要因素，另外，从GPCR信号转导的角度来看，聚集在前额叶皮层和纹状体的GPCR呈现出多态性，这种多态性有助于其通过下调儿茶酚胺类神经递质及5-羟色胺的再摄取过程，从而发挥控制多动症状及减缓认知损害的作用[17]。神经活性配体受体通路和5-羟色胺能突触功能证实了神经递质配体和受体之间的各种相互作用，单胺类神经递质相关基因的表达改变与其密切相关[18-19]。cAMP信号通路通过影响AC-cAMP-PKA信号转导的调节性神经递质（多巴胺、去甲肾上腺素和5-羟色胺）影响人类认知功能[20]。研究表明，蛋白激酶G（PKG）介导了cGMP的一些神经元效应[21]，而且cGMP-PKG是调节蛋白磷酸酶、细胞内钙水平和神经递质受体以发挥神经功能的关键分子位点[22]。

由此可见，即便是单味药，其发挥药效的化合物成分种类、作用靶点及机制也较为复杂繁多，增加了中药研究的难度。多成分、多靶点、多环节治疗疾病是中医药的优势所在，随着精准医学的兴起，中医药防治疾病的优势日益受到关注，但同时亦存在物质基础不明、作用靶点不明、疗效机制不明的发展困难。网络药理学技术借助高通量数据分析，构建成分-靶点-信号网络，可一次性处理非单一成分、靶点、途径的复杂通路，适用于中药作用机制的现代研究。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，对石菖蒲的多成分、多靶點与ADHD疾病靶点之间的复杂网络关系进行分析，在临床疗效确定的基础上，初步验证了石菖蒲治疗ADHD的药理学作用机制，为进一步从细胞生物学层面深入研究奠定基础。

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