应用Morris水迷宫实验评估银屑病对小鼠模型认知功能的影响

何磊 陈军 陈丽莉 李雪飞 王皓 刘利君 秦树存 李保强 段昕所

1承德医学院附属医院皮肤病与性病科，河北 067000；2山东第一医科大学动脉粥样硬化研究所，山东泰安 271000

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，不仅累及皮肤，还可以累及其他系统［1］。认知功能包括信息处理、注意力、学习、记忆和语言能力等。认知功能障碍（cognitive impairment）指各种原因导致的不同程度的认知功能损害，影响患者的社会功能及生活质量，给家庭和社会带来了沉重的负担。最新研究表明，银屑病患者伴有早期或者轻微认知障碍，表现为长期记忆、执行功能、注意功能、视空间功能下降，发生率高于普通人群，可达44%［2］。因此，我们拟采用Morris水迷宫实验评价银屑病小鼠模型认知功能的学习记忆能力，探索银屑病对认知功能的影响。

一、材料

1.实验动物：健康 SPF 级雄性 C57BL/6J 小鼠 20 只，10月龄，体重30～45 g，产自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号SYXK（京）2016-0006，医学实验动物合格证书编号11400700294421。实验期间小鼠饲养于泰山医学院动脉粥样硬化研究所实验动物中心标准动物房，12 h昼夜交替，室温（24±2）℃，空气湿度（50±10）%，除造模及必要的断水断食外，小鼠均可自由进水进食。实验前动物先适应性饲养1周。本实验遵循“减少、替代和优化”为核心的3R原则。

2.主要试剂与仪器：5%咪喹莫特乳膏（四川明欣药业有限公司），凡士林乳膏（河北兰炼飞天石化有限公司），小鼠水迷宫实时测试系统（美国CleverSys公司）。

二、实验方法

1.银屑病小鼠模型制备：取C57BL/6J 小鼠20 只，按随机数字表法随机分为对照组和银屑病组各10只，两组间小鼠体重差异无统计学意义（t=0.111，P＞0.05）。通过腹腔注射4%水合氯醛（0.1 ml/kg）麻醉两组小鼠后，将其背部约2 cm×2 cm毛发剃除，对照组背部外用凡士林，银屑病组参考文献［3］在背部给予5%咪喹莫特62.5 mg 每日1 次外涂。两组均连续用药1 周。水迷宫实验结束后，颈椎脱臼法处死20只小鼠，取背部约1 cm×1 cm大小皮肤组织，4%多聚甲醛固定，按常规制成蜡块，切片，HE染色，显微镜下观察，评估模型建立情况。

2.Morris 水迷宫实验［4］：造模成功后次日，用小鼠水迷宫实时监测系统监测20只小鼠的活动状况。Morris水迷宫选用小鼠通用型圆桶，水池直径100 cm，高50 cm，水深25 cm，水温控制在2 ～24 ℃，水中加白色染料，在水池壁的边沿均匀分布4 个线性标记，由此将水池等分为四个象限，选第三象限正中放置高度23 cm、直径6 cm 的平台，没入水下2 cm，迷宫外参照物保持固定。实验分为定位航行阶段和空间探索阶段。

（1）定位航行实验：将受试小鼠按顺时针方向依次自第一、二、三、四象限入水点顺序放入水中，记录60 s内寻找平台的时间（逃逸潜伏期），如果小鼠在60 s内找到平台，则小鼠达到平台的时间即逃逸潜伏期；如果在60 s 内未找到平台，逃逸潜伏期记录为60 s，以小鼠逃逸潜伏期的长短来评价小鼠的空间学习能力。

（2）空间探索实验：定位航行实验全部结束后，次日进行空间探索实验，撤去平台，然后在第一象限相同的入水点将小鼠面向池壁放入水中，记录小鼠在60 s 内穿越原平台区域的次数，以及小鼠在平台各象限停留的时间及游动距离，以此判断小鼠空间记忆存储及提取再现的能力。

三、统计学方法

四、结果

1.临床及组织病理学表现：对照组小鼠皮肤未见异常（图1A），显微镜下可见皮肤结构完整，细胞形态正常（图2A）。银屑病组第2天背部皮肤为淡红色，第3天出现红斑、少许鳞屑，随后皮肤逐渐出现皱褶、增厚，第4 ～6天，红斑、鳞屑持续增多，第7天呈典型银屑病样改变（图1B）；组织病理检查显示Munro小脓肿，表皮明显角化过度及角化不全，棘层肥厚，伴有明显毛细血管扩张和炎症细胞浸润（图2B）。

2.银屑病对小鼠空间学习能力的影响：Morris水迷宫实验结果显示，银屑病组小鼠逃逸潜伏期为（38.24±13.59）s较对照组为（14.28± 3.80）s，两组比较，t=5.37，P＜0.01。

3.银屑病对小鼠空间记忆能力的影响：Morris水迷宫实验结果见表1、图3。银屑病组平台穿越次数明显降低（P＜0.01），平台象限停留时间（P＜0.05）及平台象限游程（P＜0.01）均显著低于对照组。银屑病组在第二象限游程低于对照组（P＜0.05），在第四象限停留时间长于对照组（P＜0.05）；在一、三象限停留时间及游程两组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。

五、讨论

图1 咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型的皮肤表现 1A：对照组皮肤未见异常；1B：银屑病组皮肤肥厚，表面大量脱屑图2 咪喹莫特诱导的银屑病小鼠模型的组织学表现（HE×100）2A：对照组皮肤结构及细胞形态正常；2B：银屑病组呈典型的银屑病病理表现

认知功能障碍是指多种原因引起的知觉、学习、记忆能力等严重减退，导致知识的获取和应用障碍，常伴有行为学的异常［5］，包括不同程度的认知功能损害，从轻度认知功能障碍到痴呆。认知功能障碍对患者的影响远远大于单纯的身体功能障碍。认知功能障碍通常隐匿起病，如果不早期发现，尽早干预，认知功能障碍可能进一步加重，发展到痴呆。研究表明，糖尿病、系统性红斑狼疮等许多疾病伴有认知功能障碍，并可以增加痴呆的发生风险［6-7］。银屑病患者常伴有精神心理疾病和代谢性疾病等，使其具有更高的风险出现早期认知功能下降［8］，并且有研究表明，银屑病已经成为认知功能障碍的独立危险因素［9］。有研究显示，银屑病患者轻度认知功能障碍发病率高达44%［2］，6%～48%的轻度认知功能障碍可以在1 ～3年内进展为痴呆［10］，银屑病患者比单纯患有轻度认知功能障碍的患者出现痴呆的可能性更大［11］，并且认知功能障碍严重程度与银屑病的严重程度呈正相关［9］。姚莹等［12］的研究显示，银屑病患者的认知功能障碍发生率为30.2%，主要累及视空间功能和执行能力两个认知维度，视空间功能是对视觉信号包含的空间信息进行提取和阐释的认知过程。

Morris 水迷宫实验是行为神经科学中应用最广泛的评价动物空间学习记忆的实验方法［13］。由于啮齿类动物表现中的“视空间导航”过程也参与人类日常认知过程，因此Morris 水迷宫在认知受损的神经退行性疾病研究中具有重要意义［14］。本研究为国内外首次采用Morris水迷宫实验评价银屑病对小鼠认知功能的影响。潜伏期是Morris水迷宫定位航行阶段的重要指标，潜伏期越短，预示着动物的学习空间能力越好。本研究显示，银屑病小鼠的定位航行潜伏期显著增加，表明银屑病小鼠的空间学习能力下降。在空间探索方面，动物在平台位置穿越的次数越多，停留时间和游程越长，说明其空间记忆能力越好。银屑病小鼠穿越平台次数较正常小鼠明显降低，平台象限停留的时间及平台象限游程均显著下降，表明银屑病小鼠空间记忆能力受到损伤。这一结果与既往结论“银屑病患者用于评估视觉空间工作记忆的时间明显延长［9］”相一致。

表1 应用Morris水迷宫实验评估银屑病对小鼠模型空间学习和记忆功能的影响（±s）

表1 应用Morris水迷宫实验评估银屑病对小鼠模型空间学习和记忆功能的影响（±s）

指标穿越平台次数平台象限停留时间（s）游程（mm）第一象限停留时间（s）游程（mm）第二象限停留时间（s）游程（mm）第四象限停留时间（s）游程（mm）对照组（n=10）5.00±1.76 19.37±5.00 500.34±117.09 9.34±3.74 237.31±77.82 20.54±5.45 489.16±188.82 11.42±2.81 251.80±64.00银屑病组（n=10）1.70±0.95 13.34±4.60 251.29±71.59 11.54±3.75 206.13±51.84 21.77±6.62 309.97±126.49 14.02±1.81 290.84±78.97 t值5.21 2.80 5.74 1.44 1.05 0.46 2.49 2.46 1.22 P值＜0.01＜0.05＜0.01＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＜0.05＞0.05

图3 对照组和银屑病组小鼠水迷宫实验运动轨迹 银屑病组平台穿越次数明显低于对照组

越来越多的研究表明，小鼠的大脑皮层、皮层下区域以及海马在Morris水迷宫实验的空间学习和探索策略中发挥重要作用［15］。同样，银屑病患者在认知测试中出现无法用认知策略进行回忆信息的错误模式，与大脑皮层下额叶区域有关，研究发现银屑病患者前额皮质可能存在结构和功能的异常，其神经影像学表现为双侧岛叶皮层信号降低［2］。同时，伴有认知功能障碍的银屑病患者大脑左半球海马旁回、颞上回和额上回的脑厚度变薄，这些区域恰恰是认知功能的区域［2，16］。此外，认知功能障碍的出现也可能是由于银屑病炎症状态所致，我们前期研究表明银屑病患者不仅皮肤发生炎症，而且全身也处于炎症状态，这种炎症程度还与银屑病严重程度呈正相关［17］。炎症介质已经被证实在阿尔茨海默病的发病机制中发挥重要作用［18］，如超敏C反应蛋白、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α很可能是引起相关神经功能损伤的原因。已有研究证实，神经系统、免疫系统和内分泌系统是一个功能统一体，推测认知功能障碍是神经递质和细胞因子相互作用、各个系统互相影响的结果。

本研究初步显示银屑病小鼠认知功能下降，局限性在于样本量有限，未能对时间段、皮损严重程度与认知功能的关系进行分析，且本实验仅选择了一种银屑病经典模型，在未来研究中可以引入不同的银屑病模型进行更深入的比较。银屑病的发病机制较为复杂，而认知功能涉及机制广泛，将来可以进一步开展银屑病认知功能改变的机制研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突