乳粉中糖类的色谱及质谱检测方法研究进展

2019-12-22 16:34薛伟锋曹文军

乳业科学与技术 2019年6期

李莉，薛伟锋*，曹文军

（1.大连市检验检测认证技术服务中心，辽宁大连 116600；2.大窑湾海关技术中心，辽宁大连 116600；3.中检（大连）测试技术有限公司，辽宁大连 116600）

糖类作为乳粉中一类重要的营养成分，对人体起着至关重要的作用，如乳糖经乳糖酶作用后转化为有机酸，能够有效促进钙离子的吸收。另外，肠道健康也得益于乳糖对有益菌生长的促进作用。但有时乳糖也会起到反作用，如乳糖对某些体内缺乏乳糖酶的乳糖不耐受者危害很大，由于乳糖消化吸收功能受阻，乳糖不耐受者可能出现腹泻和腹痛等症状[1]。蔗糖虽然可以提高乳粉含糖量，但过量食用则会导致蛀牙和肥胖等。功能性低聚糖在婴幼儿乳粉中作用显著，不仅能促进婴幼儿肠道有益菌群繁殖，还能增强免疫力，提高肠道防御功能，预防感染性腹泻，改善功能性便秘[2-7]。国家标准也对婴幼儿食品中功能性糖类物质的添加量进行了规定，如GB 14880—2012《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》[8]规定，作为营养强化剂添加到婴幼儿配方食品中的功能性糖类物质总含量不得超过64.5 g/kg。尽管添加低聚糖的婴幼儿配方乳粉是乳粉行业的一大亮点，但也存在低聚糖添加量极少的尖锐问题。因此，建立乳粉中糖类的检测方法至关重要，掌握乳粉中糖含量对于了解乳粉品质和指导消费者具有重要意义。

目前，糖类的分析方法主要有酶解法[9]、气相色谱（gas chromatography，GC）法、气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[10-11]、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[12-13]、离子色谱（ion chromatography，IC）法[14-16]和液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）法等[17-19]。色谱及质谱分析方法已经成为糖类检测的最主要手段，本文在总结已有研究的基础上，结合近年研究动态，综述乳粉中糖类检测的色谱及质谱分析方法研究进展，方便科研人员选择合适的糖类检测方法。

婴幼儿乳粉基质复杂，所含糖种类多且含量差异大，因此对分离条件要求较高。尽管GC和GC-MS法对糖类的分析灵敏度较高且分离效果好，但存在样品前处理步骤复杂的问题，尤其是对某些分析物需进行衍生化反应。HPLC法受到检测器的影响，对糖类的分析灵敏度相对较低。结合优化的梯度洗脱程序的IC-电化学检测法[20-21]在糖类分析中表现出分离效果好、灵敏度高和选择性强等特点[22-23]，已被美国分析化学家协会等机构广泛应用于食品分析检测中[24]。针对复杂的乳粉样品基质，高分辨质谱在灵敏度和抗干扰能力方面表现出优势，成为未来乳粉中糖类检测方法的重要发展趋势[17-19]。本文针对上述几种方法重点阐述乳粉中糖类检测方法的研究进展。

1 GC法

孙曼泽等[25]采用GC法测定乳粉中的乳糖和蔗糖，测定乳糖的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为4.52%，回收率为94%～104%，测定蔗糖的RSD为4.35%，回收率为97.7%～102.3%；另外，根据GB 5413—1985《乳粉检验方法》[26]中的方法测得乳粉中的乳糖含量为30.5%，蔗糖含量为19.6%，2 种方法的相对误差分别为0.66%和1.50%，表明用GC法测定乳粉中的乳糖和蔗糖操作简便、分析速度快、准确度高，可以作为乳粉中乳糖和蔗糖含量的测定方法。但GC法需要对样品进行衍生化反应，反应条件较为苛刻。Block等[27]采用GC法测定11 批脱脂牛乳中异构化乳糖的含量，结果表明，GC法对于脱脂乳中异构化乳糖的检测限为50 mg/L。Montilla等[28]利用对位取代苯酚氧苷作为内标，建立乳制品中异构化乳糖含量的GC测定法，并采用该方法检测27 份商业牛乳样品，回收率为89.6%～110.6%。

2 HPLC法

HPLC是糖类检测的重要手段，在对样品进行前处理后，选取不同的色谱柱和流动相，通过示差折光检测器或蒸发光散射检测器对糖类进行分析。例如，黄红霞[29]应用HPLC对乳粉及调制乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖进行测定，将样品经简单的前处理后由碳水化合物分析柱分离，以乙腈/水为流动相，采用示差折光检测器进行检测，结果表明，乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖能够完全分离，回收率为100.4%～106.1%，RSD＜0.9%，线性相关系数（R2）在0.998 3以上，证明该方法能够简便、快速测定乳粉及调制乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖。吴莉等[30]使用HPLC对乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖进行测定时发现，样品经简单的预处理后，采用Spherisorb NH2色谱柱（0.46 cm×25 cm，7 μm）分离，以乙腈/水（体积比7∶3）为流动相，流速1 mL/min，采用示差折光检测器检测，3 种糖类能够完全分离并定量，R2达0.999，回收率为99.98%～105.10%，RSD＜0.6%，证明采用HPLC法能够对乳粉中的乳糖、蔗糖和葡萄糖进行快速、准确测定，方法简单易行。郭秀春等[31]选用市售同种品牌不同年龄段的乳粉，通过HPLC-示差折光检测器法对其乳糖和蔗糖含量进行测定，结果表明，蔗糖和乳糖的线性范围均为2～12 mg/mL，R2分别为0.999 3和0.999 6，RSD分别为2.53%和3.81%，平均加样回收率分别为99.70%和101.06%，该方法测定结果准确、分析时间短、前处理简单，适用于快速测定乳粉中的蔗糖和乳糖含量。Wang Xinmin等[32]建立了一种HPLC-示差折光检测器分析配方乳粉中氨基葡萄糖和乳糖的简单方法，样品在进行HPLC分析前经过蛋白质沉淀净化，采用昭和电工Asahipak NH2P-50柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分离，流动相为乙腈 -水（体积比7∶3），结果表明，该方法具有很好的线性（R2均大于0.99）、灵敏度（检出限分别为0.11、0.13 mg/mL，定量限分别为0.21、0.23 mg/mL）、精密度（RSD分别为1.26%和1.06%）和回收率（分别为96.5%～98.2%和97.1%～98.0%），整个分离过程在10 min内即可完成，该方法可以达到快速、简便检测乳粉中糖类的目的。

那红萍等[33]采用HPLC法，以资生堂UG80S5柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）为分析柱，示差折光检测器检测，1 次进样同时测定乳粉低聚果糖中的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖，结果表明，3 种糖的回收率为98.8%～105.9%，RSD为0.20%～0.26%，最低检出限为微克级。陈小英等[34]采用HPLC法同时测定乳粉中的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖，采用Agilent NH2色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈 -水（体积比7∶3），示差折光检测器检测，结果表明，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖质量浓度分别在0.305 0～6.100 0、0.405 4～8.108 0、0.245 7～4.914 0 mg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，R2均在0.999 5以上，3 种物质的加样回收率平均值分别为96.1%、100.3%和100.0%，RSD分别为1.5%、2.9%和3.3%，该方法简便、准确、可靠，适用于乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖3 种主要有效成分的测定。许彬等[35]采用HPLC法检测乳粉中的低聚果糖，样品经硫酸铜（质量浓度100 g/L）和氢氧化钠（质量浓度40 g/L）去除蛋白后，采用氨基色谱柱分离，示差折光检测器分析，柱温30 ℃，流速1 mL/min，流动相为乙腈/水（体积比7∶3），外标法定量，结果表明，蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖在一定质量浓度范围内线性关系良好，添加回收率分别为99.1%、99.7%和95.3%，RSD分别为0.3%、1.1%和0.3%，检出限分别为2、2、4 mg/kg，该方法快速灵敏、简便、准确，适用于乳粉中低聚果糖的检测。

Chávez-Servın等[36]建立一种HPLC-示差折光检测器定性和定量分析配方乳粉中游离单糖和二糖（包括果糖、葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳果糖和乳糖）的简单方法，结果表明，该方法具有很好的线性拟合系数（R2＞0.99），6 种糖的检测限分别为0.17、0.13、0.06、0.16、0.05、0.25 mg/mL，定量限分别为0.27、0.24、0.20、0.26、0.22、0.38 mg/mL，果糖、蔗糖、乳果糖和乳糖的RSD分别为0.78%、0.99%、2.91%和0.46%，6 种糖的回收率为93%～113%。

除了HPLC-示差折光检测器外，HPLC-蒸发光散射检测器也常用于乳粉中糖类的检测。例如，赵敏等[37]建立了一种同时测定婴幼儿配方乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖的HPLC-蒸发光散射检测器联用技术，采用氨基柱分离，乙腈-水为流动相，梯度洗脱，结果表明，6 种功能性低聚糖得到很好分离，回收率为91.8%～102.0%，RSD＜3%（n=6），该方法能快速、准确、可靠地检测婴幼儿配方乳粉中功能性低聚糖的含量。孙久玉等[38]使用蒸发光散射检测器测定配方乳粉中低聚果糖的含量，样品用体积分数75%乙醇水溶液提取，通过旋转蒸发将溶剂置换成50%乙腈水溶液，并通过C18固相萃取柱除去样品中多余的脂肪类物质，进一步净化样品，采用Waters UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相采用乙腈和水，进行梯度洗脱，结果表明，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的检出限均为20 mg/100 g，回收率在88.5%以上，RSD均小于1.5%，完全能够满足配方乳粉中低聚果糖的检测要求。

3 IC法

采用IC法测定糖类已有较多报道，如测定蜂蜜和葡萄酒[39]、蜂蜜和蜂胶[40]以及茶叶[41]中的糖等。高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法[42-44]是近年来发展起来的一种测定糖类的有效方法，该方法具有前处理简单、分离效果好和操作简便等优点[45]，已被用于牛乳和乳制品中单糖和二糖的测定[46]。利用IC法同时测定乳粉中的多种糖类已经成为一种趋势。

张水锋等[47]建立梯度洗脱-IC-脉冲安培检测技术，分析婴幼儿配方乳粉中半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖和乳糖5 种与代谢疾病紧密相关的糖类。该方法对样品的前处理、色谱柱、淋洗液梯度等色谱条件进行优化，重点研究淋洗液梯度对各组分分离效果的影响；将梯度洗脱程序分解为弱保留组分分离、乳糖分离、基质消除、系统平衡4 个子程序，并分别对其进行条件优化，实现了5 种组分的完全分离，并有效解决了弱保留组分色谱峰易重叠、乳糖色谱峰易拖尾等现象；5 种组分的线性范围为0.5～100.0 mg/L，R2＞0.9 9，方法检出限为0.0 6～0.4 0 m g/L；该方法具有分离度好、灵敏度高等优点，可满足例行分析的要求，同时也为淋洗液的梯度优化提供了可借鉴的方法。熊建飞等[48]建立高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定乳粉中葡萄糖、蔗糖和乳糖的方法，以METROSEP CARB1阴离子交换柱（4.0 m m×1 5 0 m m，5 μ m）为分离柱，37 mmol/L氢氧化钠溶液为淋洗液，以柠檬酸作为蛋白质沉淀剂，结果表明，葡萄糖、蔗糖和乳糖的线性范围分别为1～40、1～50、1～50 mg/L，R2分别为0.996 6、0.996 8和0.998 5，检出限分别为0.014、0.091、0.083 mg/L，RSD为1.10%～4.96%，回收率为90.13%～104.83%，该方法分析时间短、前处理简单，适用于快速测定乳粉中的葡萄糖、蔗糖和乳糖。

冉丹等[49]建立以电化学脉冲安培-IC法检测婴幼儿配方乳粉中低聚半乳糖（galacto-oligosaccharide，GOS）含量的方法。首先采用IC法检测经β-半乳糖苷酶酶解的原料糖浆试样中GOS含量，再以测得GOS含量的同批次原料糖浆作为对照，检测婴幼儿配方乳粉中GOS含量。通过对仪器色谱条件及前处理方法进行比较优化，发现该方法线性关系良好，R2为0.999 7，RSD为3.5%，加标回收率为87.7%～92.4%。张志国等[50]建立指纹图谱法测定婴幼儿配方乳粉中GOS含量的方法，利用IC构建GOS指纹图谱，分析得到特征组分，进而测定婴幼儿配方乳粉中GOS含量，结果表明，当称样量为1.0 g时，GOS检出限为2.5 g/kg，定量限为5.0 g/kg，线性范围为4.0～64.5 g/kg，回收率为94.0%～106.7%，RSD为1.2%～2.8%，表明指纹图谱法的准确度和精密度满足婴幼儿配方乳粉中GOS含量测定的需要。

朱伟等[51]建立了一种同时测定婴幼儿配方乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖的高效离子色谱检测技术，采用CarboPac PA20色谱柱（3.0 mm×150 mm，6.5 μm）分离，以氢氧化钠-乙酸钠为流动相，进行梯度洗脱，使用脉冲安培检测器进行检测。结果表明，8 种功能性低聚糖得到很好分离，回收率为80.0%～103.0%，RSD＜3%（n=6）。该方法能快速、准确、可靠地检测婴幼儿配方乳粉中功能性低聚糖的含量。

Cataldi等[46]建立一种简单、灵敏的用于分离和定量乳粉中单糖和二糖的液相色谱方法，经净化和适当稀释后测定样品中乳糖、半乳糖、葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖含量，分离过程在高效阴离子交换色谱仪（配备脉冲电流检测器）中完成，以金作为电极，乙酸钡的碱溶液（含10 mmol/L氢氧化钠和1 mmol/L乙酸钡）作为流动相，根据样品的不同，考虑最佳分离效果选取洗脱液，确保没有基质效应影响。结果表明，该方法具有良好的灵敏度和准确度，可以用于牛乳、干酪等乳制品中单糖和二糖的检测。

4 LC-MS法

除了GC、GC-MS、HPLC和IC外，液相色谱-质谱法也被用来分析乳粉中糖类。刘芸等[17]建立高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定乳粉中低聚果糖的方法，采用碳水化合物分析柱（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）进行分离，以乙腈与0.1%乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，质谱采用正离子模式，结果表明，该方法对蔗果三糖和蔗果四糖的检出限可达100 μg/kg，对蔗果五糖的检出限可达55 μg/kg，加标回收实验结果表明，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的平均回收率为75.8%～107.3%，RSD为1.6%～8.3%。甄振鹏等[18]建立乳粉中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖的HPLC-MS/MS检测方法，采用XBridgeTMAmide柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），以乙腈-氨水溶液为流动相进行洗脱，选择电喷雾质谱负离子源，在多反应监测模式下进行测定，结果表明，该方法对蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖的检出限分别为0.032、0.022、0.039、0.054 mg/kg，回收率为90.8%～95.8%，RSD为3.6%～9.0%（n=6）。甄振鹏等[19]还建立了测定乳粉中棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖的HPLC-MS/MS方法，同样采用XBridgeTMAmide柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm），以乙腈-水溶液为流动相进行洗脱，选择电喷雾离子源负离子模式，在多反应监测模式下进行测定，结果表明，该方法对棉子糖、水苏糖和毛蕊花糖的检出限分别为13.4、7.7、11.1 μg/kg，回收率为80.8%～86.6%，RSD为3.0%～8.0%（n=6）。

5 结语