利用HRM技术对皮南牛MSTN基因C313Y位点快速分型

滑留帅，白跃宇，王 璟，陈付英，张子敬，王风勤，徐照学，王二耀

(1. 河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，郑州 450002；2. 河南省种牛遗传性能测定中心，郑州 450046；3. 科尔沁牛业南阳有限公司，河南南阳 473555)

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNPs)是指由DNA序列中某个特定位点上单个核苷酸发生变异(转换、颠换、插入和缺失)而引起的序列多态性。与其他分子标记相比，SNPs具有分布广、密度高、遗传稳定、易于自动化检测等特点，成为继限制性片段长度多态性和微卫星多态性这两代遗传标记后的第三代遗传标记[1-2]。目前世界上关于SNPs的研究数据增长迅速，相关研究对于疾病高危群体预测、疾病相关基因鉴定、药物设计和测试、生物起源进化、生物多样性评价、动植物遗传标记、品种改良等许多生命科学领域问题都起到重要的推动作用。

高分辨率熔解(High-resolution melting, HRM)技术，是近几年来新兴起的一种SNPs检测方法。由于使用新型的饱和染料和高分辨率的仪器，HRM通过PCR之后的高分辨率熔解曲线分析，能够检测PCR片段中的单个碱基差异，因而可用于高通量的突变扫描、基因分型和甲基化分析等[3-4]。由于该技术仅在标准PCR的基础上添加饱和荧光染料而无需使用序列特异性探针，同时在PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线而无须电泳，从而具有操作简便、快速、准确、通量高、成本低等特点，并且实现了真正的闭管操作，目前受到广泛关注[4-5]。

双肌性状是指肌肉中肌纤维增多、全身肌肉总量显著增加而形成的一种表型。动物双肌性状首先在牛中发现，双肌牛的最显著特征是肌纤维普遍肥大，可引起牛肌肉质量平均增加25%。由于具有显著的肉用优势，双肌性状一直是家畜培育的关注热点。肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因功能异常是导致动物双肌性状的遗传基础[6-9]。目前在牛的MSTN基因上共发现了6个自然发生的功能缺陷型突变，其中C313Y是在MSTN基因编码区第938位核苷酸发生G到A的突变，从而引起第313位氨基酸由半胱氨酸(C)转变为酪氨酸(Y)，进而引起蛋白质失活，是皮埃蒙特牛的双肌遗传基础[6-8]。皮南牛是在河南省南阳市新野县以南阳牛为母本，以皮埃蒙特牛为父本，通过导入杂交、级进杂交和横交固定等多个阶段选育而来的高档肉牛新品系[10]。皮南牛具有优秀的肉用性能，包括生长速度快、肉质好、屠宰率高、高档牛肉切块率高等特点，因此深受市场欢迎。皮南牛作为皮埃蒙特牛的杂交牛，也部分继承了皮南牛的双肌性状。

本研究拟利用HRM建立一种MSTN基因C313Y突变的快速检测方法，进而分析目前皮南牛群体中MSTNC313Y突变的频率，以及突变对皮南牛生产性能的影响。研究结果对快速组建双肌皮南牛核心群，加强皮南牛的整体选育，进而促进中国肉牛产业的种质创新具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 样品采集

样品采自河南省南阳市新野县。使用φ=70%酒精清洁皮南牛(母牛)的耳缘部位后，用耳缺钳采集0.3 cm3大小的耳缘组织样品。将样品用PBS清洗后，至于组织样品保存液中带回实验室，-80 ℃保存。

1.2 体尺测量和体质量估计

采集组织样品的同时，测量体高、体斜长、胸围、尻宽和尻长等体尺指标，并根据公式“体质 量=体斜长×胸围2/10 800”估算体质量[2, 11]。

1.3 主要试剂

组织样品保存液(No. 9750，TaKaRa，大连宝生物)，φ=70%酒精，PBS缓冲液，组织样品基因组DNA提取试剂盒(No. DP304，天根，北京)，普通PCR试剂盒(No. KT221，天根，北京)，HRM PCR试剂盒(No. FP210，天根，北京)。

1.4 主要仪器

离心机，琼脂糖凝胶电泳仪，凝胶成像系统，紫外分光光度计(NanoDrop，美国)，普通PCR仪(Eppendorf，德国)，荧光定量PCR仪(Light Cycler 96，罗氏，瑞士)。

1.5 基因组DNA的提取

使用组织样品DNA提取试剂盒提取样品中的基因组DNA，操作步骤参照试剂盒说明书。DNA提取后，使用紫外分光光度计检测DNA的质量浓度和纯度，并进一步稀释至50 ng/μL。

1.6 利用测序技术对样品MSTN基因C313Y位点分型

利用PCR扩增所有样品的MSTN基因(GenBank登录号:NM_001001525.3)C313Y位点。引物序列为C313Y-F：CTAACTGTGGATTTTGAA，C313Y-R：TATAGCATATTAATTGGAGAC。PCR产物长度为200 bp，退火温度为60 ℃。PCR产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，然后根据测序结果对MSTN基因C313Y位点进行分型。

1.7 利用HRM技术对样品MSTN基因C313Y位点分型

使用HRM分型的引物为BT-C313Y-F：TTGGATGGGATTGGATTAT，BT-C313Y-R：CACAAGATGGGTATGAGGA。PCR产物长度为104 bp。PCR反应体系参照试剂盒说明书，其中20 μL的反应体系包含2×HRM analysis premix 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL、基因组DNA(50 ng/μL)1 μL。PCR反应体系准备完成后，置于荧光定量PCR仪中进行HRM分型，PCR反应程序为：95 ℃预变性2 min，40个循环(95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸 30 s)，最后添加1次熔解曲线分析。

1.8 统计分析

统计不同年龄段皮南牛体尺和体质量指标的均值。

利用一般线性模型(LSM)关联分析MSTN基因C313Y位点对体尺和体质量指标的影响，公式如下[12-13]：

Y=μ+ age + gene +e

其中Y为个体的表型值，μ为群体均值，age为年龄效应，gene为MSTN C313Y的基因型效应，e为随机误差。

2 结果与分析

2.1 皮南牛的体尺和体质量指标统计结果

共测定99头皮南牛的体尺指标，个体年龄从1岁～6岁不等。结果表明，3岁前属于皮南牛的快速生长期，其中1岁平均体质量为(283.04±21.41) kg，3岁平均体质量为(444.29±56.57) kg。皮南牛在3岁之后体尺和体质量指标均趋于稳定，平均体高、体斜长、胸围、尻宽、尻长和体质量分别是(127.88± 3.65) cm、(154.10± 6.89) cm、(181.48±8.54) cm、(46.19±2.94) cm、(50.52±2.65) cm和(471.34±53.78) kg(表1)。

表1 皮南牛的体尺和体质量Table 1 Body measurements and body masses of Pinan cattle

注：数值为“平均值±标准差”。

Note:the values were displayed as “Mean ± SD”.

2.2 样品的测序分型结果

利用Sanger测序的方法对皮南牛MSTN基因C313Y位点进行分型(图1)，其中纯合子个体测序结果为单峰，而杂合子个体测序结果为双峰。分型结果表明，GG型个体8个(8.08%)，GA型个体70个(70.7%)，AA型个体21个(21.21%)。

方框内展示的是C313Y突变位点，GG型和AA型均为纯合子，因此仅有一个独立的峰，而GA型杂合子有一个双峰，且该双峰的高度通常情况下为相邻峰高的一半左右 The C313Y locus is shown in the box, in which, the genotype GG and AA are homozygous, so there is only one independent peak, while the genotype GA is heterozygous, so there is a double peak and normally, the height of the double peak is just half of the height of the adjacent peaks

图1 皮南牛MSTN基因C313Y位点的测序分型示意图
Fig.1 Genotyping ofMSTNC313Y in Pinan cattle by Sanger sequencing

2.3 样品的HRM分型结果

利用HRM法对所有个体进行再次分型，分型结果见图2。不同的基因型具有不同的熔解曲线模式，其中GG型和AA型均为单峰，但出现的温度不同，GA型为双峰且峰高低于GG型和AA型，依据此熔解曲线模式可以简单快速地对个体进行分型。分型结果表明，GG型个体8个，GA型个体70个，AA型个体21个，与Sanger测序结果完全一致。

X轴是温度，Y轴为荧光强度对温度的负一阶导数(-dF/dT)。其中GG型和AA型个体均为单峰，且AA型个体的峰出现较早(左侧)，而GG型个体的峰出现较晚(右侧)。GA型个体为双峰，且峰高低于GG型和AA型 The X-axis is the temperature and the Y-axis is the negative first derivative of the fluorescence intensity versus temperature (-dF/dT). The GG genotype and AA genotype are all single peaks, and the peak of the AA genotype appears earlier (left side) than the GG genotype (right side). The GA genotype has double peaks, and the peak heights are lower than genotype GG and genotype AA

图2 皮南牛MSTN基因C313Y位点的HRM分型
Fig.2 Genotyping ofMSTNC313Y in Pinan cattle by HRM

2.4 MSTN C313Y突变对生长性状的影响

利用LSM对MSTN基因C313Y位点的不同基因型与皮南牛体尺和体质量指标进行关联分析(表2)，结果表明，杂合型突变(GA)和纯和型突变(AA)均能够显著提高皮南牛的体尺和体质量指标，GA型个体的体质量比GG型个体提高10.32%(P<0.01)，而AA型个体比GG型个体则提高38.55%(P<0.01)。

表2 皮南牛MSTN基因C313Y位点不同基因型与体尺和体质量间的关联分析Table 2 Associations between MSTN C313Y and body measurements and body masses of Pinan cattle

注：数值为“平均值±标准误”。同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:the values were displayed as “Mean ± SE”. In the same column, the difference between values marked with different capital letter was extremely significant (P<0.01), while the different lower letter showed significant difference (P<0.05).

3 讨 论

伴随着关联分析数据和功能验证数据的不断积累，SNPs在动物遗传育种工作中发挥着越来越重要的作用。其主要应用形式包括以单标记为主的标记辅助选择(Marker assisted selection, MAS)和多标记为主的全基因组选择(Genomic selection, GS)。从理论上来讲，全基因组选择包含的遗传信息更多，选择也更准确，是未来分子育种的主要方式[14-15]。但在动物选育生产实践中，有些经济性状属于质量性状，例如毛色[16]、蛋壳颜色[17]、角形[18]等，往往受单基因或单突变控制；有些经济性状虽然属于数量性状，但存在极显著的主效基因，或同样受到单突变的控制，例如产仔数[19]、肌肉沉积[20]、PSE肉[21]等。这些情况下，利用单标记辅助选择即可实现巨大的遗传进展，因而不断优化单个SNP的分型方法仍然具有重要的价值。

在育种实践中，能否开展高通量检测是一种SNP分型方法能否得到广泛应用的重要影响因素。高通量检测方法总体上可以分为两类，第一类是针对同一个样品并行检测多个位点，例如芯片、下代测序等技术，主要应用于全基因组选择。第二类是针对同一个位点并行检测多个样品，例如Taqman、KASP、质谱等技术，主要应用于单标记为主的标记辅助选择。尽管目前已经有许多高通量单标记分型技术被开发和应用，但各类方法都有需要继续改进的地方，包括成本、步骤、精度、时间等多个方面[1, 22]。高分辨率熔解曲线作为新出现的SNP分型技术，其拥有许多优点，包括无需使用荧光标记探针，不受突变种类和突变位点的限制，具有高灵敏度和特异性、高通量、操作简单灵活、成本低、闭管操作等[4-5]，有望成为重要的第二类高通量检测技术。本研究利用HRM对MSTNC313Y突变进行分型，结果表明与测序分型结果完全一致，但检测成本和检测时间却远远少于测序分型，进一步证明HRM用于SNP分型的优越性。

但是鉴于HRM的分型原理，在实际操作中也有一些需要注意的问题。首先，在检测的片段内最好只存在一个SNP，过多的SNPs往往会造成峰形混乱，进而干扰判型结果，因此扩增片段长度往往要求小于100 bp。其次，HRM依赖于高精度的荧光定量PCR仪，理想的熔解速度为0.1～0.3 ℃/s，如果设备精度不能满足要求则同样会干扰判型结果。再次，HRM依赖于饱和荧光染料，因此PCR试剂要求优质且稳定。总之，HRM分析结果依赖于靶点复杂度、模板纯度、高度特异性的HRM PCR试剂盒、高精度的荧光定量PCR仪等多个方面，需要在应用时根据具体情况进行优化。

虽然MSTN基因功能失活在家畜中可表现出显著增加肌肉产量的双肌性状，但自然发生的能够引起家畜表现双肌表型的MSTN变异类型非常有限[23-24]，其中蓝白花牛和皮埃蒙特牛是比较典型的代表[6]。利用现有双肌肉用品种改良本地品种，更是一个十分漫长的过程。在本研究中，MSTNC313Y杂合型突变(GA)和纯合型突变(AA)均能够显著提高皮南牛的各项体尺和体质量指标，且纯合突变比杂合突变具有更大的提高效果。因此，基于分子标记辅助选择MSTNC313Y纯合突变个体，对于皮南牛的综合选育具有重要的意义。而本研究中开发的基于HRM技术对MSTN基因C313Y位点快速分型的方法也具有广泛的应用价值，并且对于其他畜禽的分子标记辅助选择也具有一定的参考价值。

4 结 论

成功建立基于HRM的皮南牛MSTN基因C313Y位点快速分型方法，该方法对于快速组建皮南牛MSTNC313Y纯合突变群体，大幅度提高群体的体尺和体质量指标具有重要应用价值。