动态轴向压缩色谱法制备高纯度芍药苷

罗霖筠，王 磊，饶桂维*

(1.浙江树人大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310015;2.杭州师范大学 钱江学院理工分院，浙江 杭州 310018)

白芍为毛茛科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)的干根，白芍中的主要有效成分之一是白芍总苷，其中芍药苷占白芍总苷的90%以上，是白芍主要活性成分[1]。芍药苷是一种单萜类糖苷化合物，最早于1963 年从毛茛科植物芍药中提取[2]。具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的作用[3]。此外，《中华人民共和国药典》(2015版)将芍药苷的含量作为白芍的质量评价指标[3]。大量现代药理研究表明，芍药苷具有抗肿瘤、抗氧化、抗抑郁、免疫调节和补血等药理作用，其药用价值日益受到重视[4-12]。芍药苷的提取分离方法有很多研究报道，包括水煎煮法、回流法、超声提取法和微波提取法等传统方法。陈赟[13]使用水煎煮法以40%乙醇为提取溶剂，80℃提取，2 h/次，芍药苷提取率为35.4%。水煎煮法可以节约成本，但是由于原料中化合物组成复杂，在加热过程中会提取出其他水溶性物质，降低后续提纯效率。黄夏敏等[14]在研究中发现，白芍传统水煎煮工艺中，芍药苷损失率高达40%以上，受热破坏是从白芍中提取芍药苷生产工艺中含量下降的主要原因，因此，工艺过程中应避免长期高温受热。回流提取法，芍药苷含量降低随着回流时间的延长而降低，因此长时间的提取和加热会导致活性成分的破坏。陈建平等[15]采用超声波辅助技术提取白芍中芍药苷，提取条件为：料液比为1∶15(g/mL)，超声温度为60℃，超声时间为20 min，乙醇浓度为60%，超声功率为75 W，提取率为0.296%。超声提取法乙醇用量大，回收周期长，提高了芍药苷的提取成本，由于工艺复杂、生产设备成本高，不适合工业化生产。黄天辉等[16]优化了微波辅助提取白芍中芍药苷的方法，最佳优化条件为微波功率850 W、乙醇体积分数90%、料液比1∶12、提取时间25 min。该方法不仅提取时间短、效率高，平行性好，而且节省了提取时间和溶剂，为其在工业生产中的应用提供参考；但也存在生产仪器成本高的问题。

然而，随着科学技术的发展和对天然产物、生物制药、中草药等领域的深入研究，人们对精华物质的质量的需求越来越高，传统的制备技术已经不能满足市场需求，需要更低成本，更高效率的替代技术。

动态轴向压缩技术(Dynamic axial compression,DAC)是工业色谱中最常用、最容易实现的、效果更为理想的制备色谱装填技术。柱内填充匀浆填料及加压活塞，在装填和使用过程中始终保持填料柱床压缩状态以确保其均匀无空隙，可有效避免色谱柱空隙的形成，确保色谱柱的稳定性良好。DAC作为一种新型的制备色谱技术，因其柱效高，重复性好、分离效率高、制备量大等优点而受到越来越多的关注。随着科学技术的发展，制备色谱在中草药有效成分的分离制备、天然植物的提取[20-21]、生物医药领域的分离及制备色谱法分离纯化合成药物[24]等方面取得了许多成果。高明哲等[18]用工业制备高效液相色谱，通过两步分离从积雪草中分离制备积雪草甙和羟基积雪草甙2种对照品，采用C18柱(50 mm×200 mm，5μm)，甲醇-水(60∶40)洗脱，20 min实现这两种成分的分离及制备，产品纯度均达到98%以上，实现了快速高效且高纯度产物制备。陈文娟等[19]采用MCI柱层析法提取牛耳，半制备型高效液相色谱法分离制备了五种苯乙醇苷类单体。使用外标法对所得五种单体进行了定量分析，其纯度均在98%以上。田娜等[22]从经乙醇处理的荷叶提取出Fr-1组分，在反向C1810 μm制备柱上用乙睛-水线性梯度洗脱，从荷叶中分离得到金丝桃苷、异槲皮苷和紫云英，三种化合物的纯度都均在97%以上，其中首次从荷叶中分离得到紫云英。Sakuma等[23]采用大型反向动态轴向压缩柱从三形科植物红柴胡中分离出了3种皂苷成分saikosaponins a.c和d，采用三步梯度法得到了3种的皂苷的纯组分，产物收率90%以上，各单体皂苷中的杂质含量均小于1%。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白芍(购自药店)，芍药苷标准品(购自阿拉丁)，MCI聚苯乙烯聚合物凝胶(日本三菱)。甲醇为色谱纯(TEDIA 天地试剂公司)，乙醇为分析纯(杭州青辰化学试剂厂)。实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

福立FL2200液相色谱系统，包括二元泵、紫外可见光检测器；FDU-1200立式冷冻干燥 日本理化公司；LC6000工业化制备液相系统 北京创新通恒科技有限公司；KQ5200DE 型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；DF-101B集热式磁力加热搅拌器 金坛市国旺实验仪器厂；MS205DU 电子天平(METTLER TOLEDO)；RV10 digital旋转蒸发仪，包括真空泵； UPWS超纯水器 杭州永洁达净化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

在芍药苷标准品及纯度检测分析条件为室温30℃，色谱柱为室温，流动相为甲醇-水(体积比：65∶35)，进样体积为10 μL。体积流量1.0 mL/min；流速为1.0 mL/min，检测波长为230 nm。

1.3.2 样品含量测定与计算

将制备好的样品用甲醇溶解，进行液相色谱分析，采用外标法，根据峰面积计算样品中各组分芍药苷含量。采用Excel 2010、SPSS20.0进行数据处理和分析。

1.3.3 芍药苷粗品的制备

取白芍粉末5.0 g，用2倍量90%乙醇提取，收集提取后洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，得芍药苷粗品5.18 g备用。

1.3.4 对照品溶液的制备

精密称取芍药苷标准品适量，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，即得。

1.3.5 供试品溶液的制备

精密称取1.3.3下粉末100 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

1.3.6 标准曲线的绘制

准确称取芍药苷标准品5 mg，加甲醇使之溶解，定容至50 mL容量瓶中，标记为“标准储备液”，置于4℃冰箱备用。分别取2、4、6、8 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。配置得0.1、0.08、0.06、0.04、0.02 mg/mL的标准工作溶液。

1.3.7 线性放大

线性放大原理是基于不同色谱系统的恒定化学性质和传质过程的等线性放大。线性放大不仅是简单的放大分析，还需考虑色谱柱大小、进样体积、填料性质、流速、进样量、产品纯度、回收率等。线性放大系数计算公式如式所示：

其中X为线性放大系数，L1为放大前色谱柱长度，L2为放大后分析柱的半径；r1为放大前的制备柱半径。r2为放大后色谱柱长。

1.3.8 色谱分离条件优化

实验所用分析柱为HypersiL ODS2 C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；半制备柱为SunFire C18OBD Prep Column,10 μm,19 mm×250 mm；动态轴向制备柱内径为50 mm，装填料为Daisogel C18,10 μm，装填高度为500 mm。

在分析柱上建立了芍药苷样品及纯度检测方法。通过有机相考察及超载研究，确定合适制备方法的分析型色谱方法。根据线性放大理论，完成从芍药中提取高纯度芍药苷分析、半制备、制备逐级放大。并对样品进行定性、峰面积归一化纯度检测。

芍药苷制备分析条件为：室温下30℃，色谱柱温度为室温，流动相为甲醇-水溶液体积比(体积比：65∶35),流速为118.0 mL/min，检测波长为230 nm。

2 结果与分析

2.1 分析条件优化

2.1.1 MCI柱色谱洗脱剂的筛选

取MCI聚苯乙烯聚合物凝胶18 g，取“1.3.3”项下的提取液5 mL上样，平行3份进行样品吸附后，洗脱体积与树脂质量比为2∶1。分别用 40%、60%、80%、90%乙醇溶液36 mL进行洗脱，收集洗脱液，HPLC法进行测定，计算芍药苷含量及洗脱率，结果见表1～4。实验表明90%乙醇作为洗脱溶剂洗脱率最高。

表1 40%乙醇对芍药苷洗脱影响

表2 60%乙醇对芍药苷洗脱影响

表3 80%乙醇对芍药苷洗脱影响

表4 90%乙醇对芍药苷洗脱影响

2.1.2 分析柱浓度超载

实验条件如1.3.1所述，在保证相同进样体积的前提下，选取不同浓度进样，分别以因素变化考察其对分离效果的影响。实验中选择进样体积10 μL，样品浓度分别为2、10、20、30、100 mg/mL对芍药苷粗品溶液，实验结果如图1所示。

图1 不同样品浓度分离叠加图

Fig.1 The HPLC chromatograms of different concentrations

从图1结果可知，随着进样浓度的增加，相应的峰面积也在增加中，在2到30 mg/mL时差异不大，当进100 mg/mL时，目标物峰高变高明显。

2.1.3 分析柱体积超载

实验条件如1.3.1所述，在保证相同进样浓度的前提下，选取不同体积进样。实验中选择进样浓度为100 mg/mL，进样体积分别为1、3、5、10、20 μL芍药苷粗品溶液，实验结果如图2所示。

图2 不同样品体积分离叠加图

Fig.2 The HPLC chromatograms of different volumes

从图 2结果可知，随着进样体积的增加，目标峰高也增加，1、3、5、10 μL时上升变化不大，在进样体积达到20 μL时，变化明显。

由上述两个超载试验，最终确定适合制备放大的分析型色谱条件为：室温下，色谱柱为(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇：水(体积比为65∶35)，流速为1.0 mL/min，进样体积为20 μL进样浓度为100 mg/mL，检测波长为230 nm。

2.1.4 线性放大

超载实验最终选定了分析型系统上的最佳分析型分离条件为：进样浓度为100 mg/mL，进样体积为20 μL，流速为1.0 mL/min。根据线性放大理论结合1.3.7线性放大公式得到半制备及制备型系统上的理论条件，实验结果如表5所示。

表5 分析、半制备和制备的分离条件

2.1.5 半制备及工业色谱分离芍药苷

采用半制备柱为SunFire C18OBD Prep Column，10 μm，19 mm×250 mm进行半制备芍药苷。将1.3.3项下芍药苷粗品用甲醇溶解后进样，体积流量为17 mL/min；进样体积2 mL，收集11.5 min时间流分，浓缩至干。

采用动态轴向压缩工业色谱柱(50 mm×500 mm)，装填Daisogel C18,10 μm填料，制备纯化芍药苷。将1.3.3项下芍药苷粗品用甲醇溶解后进样，体积流量为118 mL/min；进样体积5 mL。收集12.5 min时间点洗脱的流分，浓缩干燥，得到淡黄褐色粉末。半制备型分离及制备型分离色谱图如图3、4所示。

图3 芍药苷半制备分离

Fig.3 Semi-preparation separation of paronifiorin extracts

图4 芍药苷制备分离

2.1.6 收集组份芍药苷纯度测定

分别取芍药苷对照溶液和供试品10 μL，在“1.3.1”项色谱条件下进行测定，使用外标法计算出经动态轴向压缩工业色谱制备芍药苷的含量为96.14%。

2.2 线性关系考察

在1.3.1色谱条件下，分别对配制好的不同浓度的芍药苷标准工作溶液进行测定，以色谱峰面积对相应的浓度作图，得出标准曲线y=2120.2X-230.96,R2=0.993，芍药苷在0.1130～1.010 mg/mL-1范围内呈良好的线性关系。

3 讨论

本实验从分析(ID 4.6 mm)、半制备(ID 19 mm)到制备(ID 50 mm)逐步放大，实现了目标组分的分离纯化，收集芍药目标组分经HPLC峰面积归一化法得到。

考虑到大规模制备的成本和分离效果，本实验以白芍为原料，经提取、浓缩、冷冻干燥后，采用动态轴向压缩工业色谱快速分离制备芍药苷。

芍药苷为白芍中的活性成分，但在白芍中的含量并不高，因此，其标准品昂贵，直接用于研究其药理活性和药效的成本较高。在本实验中，建立了一种快速制备高纯度芍药苷的方法，所得化合物的纯度达96.14%。