PM2.5短期暴露对大鼠子宫组织的损伤及其作用机制

张丰泉，董恩恒，薛玉雪

(新乡医学院 公共卫生学院 新乡市大气污染健康效应与干预重点实验室，河南 新乡 453000)

颗粒物(particulate matter，PM)是空气污染物的重要组成成分，按粒径分为总悬浮颗粒物(TSP)、可吸入颗粒物(PM10)、细颗粒物(PM2.5)和超细颗粒物(PM0.1)。研究证实PM2.5是多种疾病的重要危险因素，可诱发呼吸系统、心血管系统和代谢性疾病。流行病学调查结果显示，PM2.5能够抑制胎儿发育，导致不良妊娠结局[1-2]，因而PM2.5被认为是生殖系统的危害因素之一。我们前期实验结果证实，PM2.5急性暴露能影响妊娠结局，使雌鼠的不良妊娠率明显升高[3]。但目前PM2.5生殖损伤的研究主要集中于流行病学调查方面，而其生殖损伤致病机理的研究还非常有限。

内质网不仅是细胞内蛋白质、脂类和糖类合成的基地，而且是细胞内重要的物质传输和信号传导通路。已有研究证实内质网应激与多种疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病、糖尿病等)的发生、发展相关[4]。另有研究发现，内质网应激在PM2.5诱发肺、肝损伤中被激活，是PM2.5致肺脏和肝脏损伤的重要作用机制[5]。最新的研究发现，内质网应激同样在PM2.5的斑马鱼胚胎发育损伤中起重要作用[6]。内质网应激能够激活促凋亡基因caspase-3进而诱发细胞凋亡。已有研究证实凋亡是子宫细胞死亡的重要方式，对子宫起重要调节作用[7-8]。本研究中将雌鼠暴露PM2.5后，检测子宫组织内质网应激信号通路相关蛋白及其下游凋亡调控蛋白caspase-3的表达情况，进而阐述内质网应激在PM2.5生殖毒性中的作用和机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

30只8周龄清洁级雌性SD大鼠，体重180～200 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2012-0001】，饲养于新乡医学院屏障动物房【SYXK(豫)2014-0005】，室温22～24℃，12 h/12 h昼夜交替，相对湿度50%～60%，适应性喂养1周。所有操作均符合实验动物福利和伦理委员会的要求(XXMU-2015-0021)。

1.1.2 主要仪器和试剂

荧光定量PCR仪(LightCycler 96， Roche，瑞士)，蛋白垂直电泳系统(Mini-PROTEAN Tetra，Bio-Rad，美国)，凝胶成像分析系统(FluorChem R，ProteinSimple，美国)，显微镜(AE2000，麦克奥迪，中国)，TUNEL原位染色试剂盒(TACS·XL DAB Kit， Trevigen, 美国)，TRIzol和荧光定量PCR试剂盒购于Invitrogen公司，GRP78、PERK、CHOP、eIF2α和cleaved caspase-3一抗购于Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组

参考已有研究设计本次实验PM2.5暴露剂量。将30只雌鼠随机分为生理盐水对照组(Con)、1.5 mg/(kg·bw) PM2.5低剂量暴露组(L-Exp)和6 mg/(kg·bw) PM2.5高剂量暴露组(H-Exp)[9]，每组10只。

1.2.2 PM2.5染毒

将收集的PM2.5配置成3 mg/mL低浓度和12 mg/mL高浓度悬液，配置方法参照我们前期的实验[3]。将制备的PM2.5悬液复温重悬后，参照晋乐飞等[10]吸入式气管暴露法进行PM2.5染毒。大鼠麻醉后，用棉线绳挂住大鼠上切牙将大鼠垂直悬挂，镊子拉出大鼠舌头，吸取50 μL/100(g·bw) PM2.5悬液注入大鼠舌根部，并快速捏紧大鼠鼻腔，迫使大鼠经口腔将PM2.5液吸入肺内，当听到肺部湿罗音表示吸入成功。染毒后，大鼠自由活动，连续染毒30 d。对照组采用同样的方法吸入50 μL/100(g·bw)的生理盐水。

1.2.3 子宫组织病理学观察

取新鲜组织用生理盐水漂洗，4%多聚甲醛固定，酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋并切成5～6 μm厚的切片，常规HE染色，显微镜下观察子宫组织病理学变化。

1.2.4 子宫组织细胞凋亡检测

采用TUNEL原位染色法检测子宫组织细胞凋亡情况。常规方法将子宫组织石蜡切片脱蜡、复水处理，然后严格按照试剂盒说明进行组织切片标记染色。滴加2%蛋白酶K(V/V)，室温孵育15 min，去离子水漂洗2次(每次5 min)。3% H2O2(V/V)浸润5 min以灭火组织中的过氧化氢酶，去离子水漂洗1 min。滴加50 μL混合标记试剂，湿盒中37℃孵育1 h，然后加入100 μL反应终止液，PBS漂洗2次，每次2 min。切片上滴加50 μL抗体液，湿盒中37℃孵育30 min，PBS漂洗2次。滴加50 μL Strep-HRP液，湿盒中室温孵育10 min，PBS漂洗2次，然后加入100 μL DAB液显色3 min，去离子水漂洗2次，每次2 min。1%甲基绿复染30 s，然后梯度酒精脱水、二甲苯浸润透明、封片，显微镜下观察计数凋亡细胞。在×200镜下每张切片随机选择5个视野，计数细胞总数和凋亡细胞数，计算细胞的凋亡率，每组计数6个样本。

1.2.5 子宫组织中内质网应激相关基因和caspase-3 mRNA表达检测

TRIzol试剂盒提取子宫组织总RNA，反转录合成cDNA。荧光定量PCR法检测GRP78、PERK、CHOP和eIF2α mRNA表达水平。目的基因引物序列见表1。扩增反应条件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 20 s，45个循环。用2-△△CT值计算目的基因的相对表达量。每组检测6个样本。

表1 荧光定量PCR目的基因引物序列Table 1 Primer sequences of target genes for Real-Time PCR

1.2.6 子宫组织中内质网应激相关蛋白和cleaved caspase-3蛋白表达检测

提取子宫组织中的总蛋白，并用BCA试剂盒测定样品蛋白含量。取25 μg蛋白样品，经SDS-PAGE凝胶电泳后，将目的蛋白分别转膜至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭1.5 h，加入GRP78一抗(1∶200)、PERK一抗(1∶500)、eIF2α一抗(1∶500)、CHOP一抗(1∶300)、cleaved caspase-3一抗(1∶500)、β-actin一抗(1∶3000)，4℃孵育过夜，洗膜后加入二抗(1∶5000)室温孵育90 min，ECL发光，凝胶成像系统成像并分析。每组检测6个样本。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 子宫组织病理学改变

不同剂量PM2.5暴露后，雌鼠子宫组织的病理学改变见图1。对照组可观察到正常的子宫内膜单层柱状上皮细胞，且排列比较紧密和结构完整的腺体；同时固有层中含有丰富的基质细胞(图1A)。低剂量暴露组子宫内膜上皮细胞发生不同程度的萎缩，细胞间隙增大，且少数细胞出现空泡化；腺体细胞同样发生萎缩变薄(图1B)。高剂量组子宫内膜上皮进一步萎缩，空泡化细胞增多；腺体细胞萎缩更严重(图1C)。

2.2 子宫组织细胞凋亡检测结果

注：白色箭头：空泡化的上皮细胞；黑色箭头：萎缩的腺体。图1 子宫组织病理学改变(×400)Note. White arrow, vacuolated epithelial cells. Black arrow, atrophic glands.Figure 1 Pathological changes in the uterine tissues(×400)

镜下观察组织细胞如发生凋亡会被TUNEL染成深褐色(见图2)。对照组大鼠子宫组织细胞的凋亡率为(9.93±1.66)%，低剂量暴露组子宫组织细胞凋亡率为(29.40±6.96)%。与对照组相比，低剂量暴露组细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。高剂量暴露组细胞凋亡率为(43.58±8.23)%，其凋亡率明显高于对照组(P<0.01)和低剂量组(P<0.05)。

注：黑色箭头：凋亡细胞。图2 TUNEL凋亡检测结果(×200)Note. Black arrows, apoptotic cells.Figure 2 Detection of apoptosis in the uterine tissues(TUNEL staining,×200)

2.3 PM2.5对子宫组织GRP78、PERK、eIF2α、CHOP mRNA表达水平的影响

子宫内质网应激相关基因mRNA相对表达量见图3。与对照相比，低剂量和高剂量PM2.5暴露组大鼠子宫GRP78、PERK、eIF2α、CHOP mRNA表达量均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

与低剂量暴露组相比，高剂量暴露组中GRP78、PERK mRNA的相对表达量明显升高(P<0.05)；CHOP和eIF2α表达量虽高于低剂量暴露组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

注: 与对照组相比，aP<0.05；与低剂量暴露组相比，bP<0.05。图3 PM2.5对GRP78、PERK、CHOP和eIF2α mRNA表达的影响Note. Compared with the control group, aP <0.05. Compared with the L-Exp group,bP <0.05.Figure 3 Effects of PM2.5 on the mRNA expressions of GRP78, PERK, CHOP and eIF2α

2.4 PM2.5对子宫组织内质网应激相关蛋白和cleaved caspase-3蛋白表达水平的影响

短期PM2.5暴露后，低剂量和高剂量暴露组大鼠子宫中内质网应激相关蛋白GRP78、PERK、eIF2α、CHOP的蛋白表达量均明显高于对照组(P<0.05)(图4A-D)。与低剂量暴露组相比，高剂量暴露组中GRP78、PERK和eIF2α蛋白表达量明显升高(P<0.05)；CHOP表达量虽高于低剂量暴露组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

与对照组相比，低剂量和高剂量暴露组子宫中cleaved caspase-3蛋白的表达量均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)(图4E)。

注： 与对照组相比，aP<0.05；与低剂量暴露组相比，bP<0.05。图4 PM2.5对子宫内质网应激相关蛋白和cleaved caspase-3蛋白表达的影响Note. Compared with the control group, aP <0.05. Compared with the L-Exp group,bP <0.05.Figure 4 Effects of PM2.5 on the expression of protein of endoplasmic reticulum stress and cleaved caspase-3

3 讨论

研究指出，随着空气污染的持续，空气污染相关疾病的发病率和死亡率将不断升高，到2050年时每年将有660万人死于空气污染相关疾病[11]。越来越多的研究显示，孕期暴露PM2.5对胎儿的发育和分娩产生不良的影响[1-2,12-13]。Son等[14]的研究指出，PM2.5暴露可使新生儿死亡率升高2.66倍。另有研究结果显示，妊娠期暴露PM2.5仅对新生儿出生体重有明显影响，但对妊娠周期没有影响，不会造成新生儿早产(OR=0.86)[15]。但也有研究结果却显示PM2.5对妊娠结局没有影响[16]或影响非常有限[17]。目前PM2.5的生殖毒性以及其对妊娠结局影响的研究结果存在差异性和不一致性的原因可能与调查对象所处妊娠时期、暴露PM2.5浓度和时长以及不同地区PM2.5所含化学成分不同等有关。虽然我们早期的实验证实，PM2.5暴露对妊娠结局有不良影响[3]，但目前PM2.5生殖毒性的作用机制还不太清楚。

目前关于空气中PM2.5对机体损伤效应的实验大多是急性毒性实验，为了研究更长时间PM2.5暴露的毒性作用，本次实验将SD雌鼠的暴露时间延长为30 d的短期暴露，从而观察PM2.5对雌鼠子宫损伤效应。PM2.5短期暴露后，雌鼠子宫组织结构发生了明显的病理损伤变化，造成子宫内膜上皮细胞萎缩，细胞间隙增大，且细胞出现空泡化；同时腺体也出现萎缩现象(见图1)，由此结果可见空气中PM2.5短期暴露对子宫组织结构有损伤，PM2.5具有生殖毒性。

已有研究证实PM2.5可通过活化T-细胞免疫蛋白和TIM蛋白，进而诱发肺组织凋亡[18]。Yang等[19]的研究发现，心肌细胞暴露PM2.5后，细胞中的氧化应激水平升高，触发bcl-2-bax-caspase-3凋亡信号，进而诱发心肌细胞凋亡。由此可见PM2.5可通过多途径诱导组织细胞发生凋亡。本次研究中我们采用TUNEL法检测雌鼠短期暴露PM2.5后子宫组织细胞凋亡情况。实验结果表明，低剂量和高剂量PM2.5暴露组细胞凋亡率均明显高于对照组。caspase-3是caspase家族中具有重用凋亡调控重用的蛋白，也是内质网应激信号通路下游重要的凋亡调节蛋白，而cleaved caspase-3蛋白是反映凋亡的标志蛋白。本实验中为了验证子宫细胞凋亡的发生，我们同时检测了子宫cleaved caspase-3蛋白表达水平。实验结果表明，低剂量和高剂量PM2.5暴露组子宫cleaved caspase-3蛋白表达量明显高于对照组(结果见图4E)，与TUNEL检测结果相一致。由以上结果可知短期暴露PM2.5可诱导子宫细胞发生凋亡，进而推测PM2.5生殖损伤作用可能与其诱发的细胞凋亡有关。

内质网不仅是合成和分泌蛋白的场所，同时还可介导细胞的凋亡信号通路[20]。内质网功能混乱会使未折叠或错误折叠的蛋白堆积于细胞内，并诱发内质网应激反应。过强的内质网应激导致细胞发生未折叠蛋白质应答反应(UPR)，进而触发细胞内的凋亡信号传导通路，诱发细胞凋亡。UPR主要受到跨膜蛋白如PERK、肌醇酶1(IRE1)和活化转录因子6(ATF6)调控。这些跨膜蛋白通常是以与GRP78结合的复合形态存在于内质网膜上。当未折叠蛋白过度堆积时，GRP78会与跨膜蛋白分离后与未折叠蛋白结合，进而导致内质网应激和UPR[21]。PERK是内质网膜上的一种感受蛋白，在UPR初期可以调控蛋白的合成减轻内质网应激。在内质网应激过程中，PERK与GRP78分离后，进而增加促凋亡蛋白CHOP的表达，最终活化caspase-3从而激活细胞凋亡信号通路，促使细胞发生凋亡[22]。PERK- eIF2α-CHOP信号通路是重要的内质网应激反应通路。Laing等[5]研究发现PM2.5通过PERK-eIF2α-CHOP信号通路介导的内质网应激诱发肺和肝脏组织细胞凋亡。为了探究内质网应激在PM2.5诱导子宫组织凋亡中的作用，本实验中我们检测了PERK- eIF2α-CHOP信号通路中的关键蛋白的表达情况。雌鼠暴露PM2.5后，子宫中GRP78、PERK、eIF2α和CHOP在mRAN和蛋白水平的表达水平均明显升高(结果见图2和3)，由此实验结果可知短期暴露PM2.5可使内质网应激信号通路中GRP78、PERK、eIF2α和CHOP蛋白表达水平升高，激活PERK- eIF2α-CHOP信号通路。

综合本次实验结果，我们推测短期暴露PM2.5对子宫的损伤作用可能与PERK- eIF2α-CHOP信号通路介导子宫组织发生内质网应激反应，并诱导子宫组织细胞发生凋亡有关。但本次实验中未对内质网应激中其他信号通路中的关键蛋白进行检测，不能确定短期暴露PM2.5是否会通过其他信号通路诱发内质网应激，因而在之后的实验中还需进一步验证。