改良减少子宫血流灌注法建立子痫前期大鼠模型

黄文亭，曾子纯，王冬菊，肖小敏

(暨南大学 附属第一医院， 广州 510632)

子痫前期(pre-eclampsia, PE)是妊娠期特有的多系统疾病，临床表现以由全身血管内皮系统广泛损伤为主要病理基础的高血压、蛋白尿为主，是导致围产期母婴死亡的主要产科并发症之一[1]。为了研究妊娠高血压疾病的发病机制及探索诊治方法，目前国内外有多种方法可建立妊娠期高血压模型。其中传统的减少子宫血流灌注(reduced-uterine perfusion pressure, RUPP)手术建立PE模型，由于能较针对性地引起由于胎盘缺血缺氧导致的妊娠高血压，接近临床上 PE 的发生机制，加上未使用药物建模，可减少建模药物对实验结果的影响，相比其他建模方式为多人选择[2]。本实验对RUPP手术建模方法进行改良，比较了RUPP+灌水法与传统RUPP法建立子痫前期模型的效果差异。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级Wistar大鼠39只，由广州中医药大学动物实验中心提供【SCXK(粤)2013-0034】，体重(250 ± 20)g，饲养于暨南大学动物实验中心【SYXK(粤)2017-0174】。每晚将雌鼠与性成熟雄性大鼠按雌雄比 2∶1～3∶1合笼过夜，次日取雌鼠阴道分泌物涂片后在显微镜下观察，见精子者定为孕0 d，妊娠后常规喂养。该实验已通过暨南大学实验动物伦理委员会伦理审查(受理号20150205001)。

1.2 方法

1.2.1 孕14 d

开腹手术，同时观察妊娠仔鼠数将已孕14 d的雌性大鼠随机分为三组：(1)RUPP组16例：观察并记录孕仔数后实施RUPP手术，关腹后不给予任何干预。(2)RUPP+灌水组10例：实施RUPP手术后每日给予双蒸水2 mL灌胃。(3)假手术组13例：开腹暴露腹主动脉及双侧卵巢动脉，不钳夹血管。观察并记录孕仔数后即关腹，关腹后不给予任何干预。

RUPP手术方法：孕14 d大鼠异氟烷诱导麻醉后，3%戊巴比妥钠按4 mL/kg腹腔注射麻醉，沿下腹正中线开腹，暴露腹主动脉下端、子宫及卵巢动脉，于腹主动脉下段近髂动脉分叉起始处置银夹1枚钳夹血管，左右两侧子宫动脉第一分叉前分别置银夹1枚，该法可使子宫血流灌注减少到40%，胎盘处于缺血缺氧状态，常规关腹[2]。

1.2.2 孕18～20 d

观察血压、尿蛋白及妊娠结局(1)血压测量：于孕19 d当天12:00前完成有创颈动脉插管，晚间20:00-21:00及第二天8:00-9:00清醒状态下测量有创动脉血压2次取平均值。(2)尿蛋白：于孕18 d放DXL-10不锈钢标准大鼠代谢笼，留取24 h尿液，测量24 h尿蛋白定量。(3)仔鼠状态的判断：孕20 d测压结束后腹腔注射麻醉下行剖宫产，观察记录仔鼠死亡、畸形情况。成仔鼠为活产与死、畸胎仔总和。分别对活胎及死胎统一称重，再除以其胎数取平均值。分别对活胎胎盘及死胎胎盘称重，取其均数。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 孕鼠一般情况

实验过程中发生了孕鼠死亡及仔鼠全部吸收的情况，其中假手术组、RUPP组、RUPP+灌水组纳入实验孕鼠总数分别为13例、16例、10例，死亡孕鼠分别为0例、2例、0例，胎仔全吸收孕鼠分别为0例、4例、1例。经χ2检验，三组间死亡率及吸收率差异均无显著性(P=0.785，P=0.110)，因此将死亡孕鼠及胎仔全吸收鼠剔出实验，纳入后续研究孕鼠数量分别是：假手术组13例、RUPP组10例及RUPP+灌水组9例。

2.2 三组孕鼠建模效果比较

2.2.1 三组孕鼠孕19～20 d血压比较

建模后孕鼠收缩压、舒张压及平均动脉压均有不同程度上升，差异有显著性(P<0.05)；其中RUPP+灌水组血压上升明显，三项指标较其余两组差异均有显著性(P<0.05)；RUPP组舒张压与假手术相比差异无显著性(P=0.122)。(表1)

2.2.2 三组孕鼠孕18 d，24 h尿蛋白比较

假手术组18 d，24 h尿蛋白为(3.47±1.32)mg，RUPP组为(4.96±0.85)mg，RUPP+灌水组为(4.14±1.05)mg，三组差异有显著性(P=0.013)，其中RUPP组与假手术组相比显著增高，差异有显著性(P<0.05)，RUPP+灌水组与RUPP组及假手术组组间比较差异均无显著性(P=0.103，P=0.183)。

2.2.3 三组孕鼠孕14 d及孕20 d胎仔数比较

各组孕鼠其孕20 d活仔率、成仔(活仔与死畸胎数之和)率为非正态，故使用中位数(M)进行检验，多组检验方法为 Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较使用Mann-Whitney检验。如表2所示，造模前孕14 d时各组孕仔差异无显著性(P>0.05)，手术后，三组孕20 d活仔率及成仔率差异有显著性(P=0.000)；组间比较，假手术组孕20 d活仔率及成仔率明显高于RUPP组及RUPP+灌水组，差异有显著性(均P=0.000)，RUPP组与RUPP+灌水组间比较差异无显著性(P=0.968，P=0.549)。

表1 三组孕鼠孕20 d血压比较Table 1 Comparison of blood pressure of the pregnant rats on G20 day among the three groups ± s)

注：与假手术组相比，aP<0.05。与与RUPP组相比，bP<0.05。

Note. Compared with the sham operation group，aP<0.05. Compared with the RUPP group，aP<0.05.

表2 三组孕鼠孕14 d孕仔数及孕20 d胎仔数比较Table 2 Comparison of the numbers of fetuses on G14 day and litters on G20 day among the three groups ± s)

注：与假手术组相比，aP<0.05。

Note. Compared with the sham operation group，aP<0.05.

2.2.4 三组胎仔体重及胎盘湿重比较

三组间孕20 d活仔体重及胎盘湿重差异有显著性，其中假手术组活仔体重明显高于RUPP组及RUPP+灌水组，差异有显著性(P<0.05)，而RUPP组及RUPP+灌水组间差异无显著性(P=0.746)。RUPP+灌水组胎盘湿重明显低于假手术组，差异有显著性(P<0.05)，RUPP组与RUPP+灌水组差异无显著性(P=0.080)。(表3)

3 讨论

3.1 常见PE动物模型建立方法

目前，子痫前期的发病机理尚不清楚，比较公认是与子宫胎盘缺血缺氧有关，另外也与水钠代谢遗传异常、神经功能紊乱、各种血清因子释放异常等相关。因此，目前常见的子痫前期动物模型建立方法包括[3]：(1)手术钳夹腹主动脉或子宫动脉，减少子宫血流灌注，造成子宫胎盘缺血缺氧[4-5]。此法可快速建立模型，且缺血部位明确，也避免了药物对实验本身的干扰。但造模成功率不稳定，也无法体现滋养细胞侵噬不足、胎盘浅着床等特异性PE病理改变。(2)品系为BPH/5小鼠和Dahl盐敏感性大鼠的子代重复交配，可在自然培育的情况下产生高血压，具有一定遗传性[6]。此法无人工干预，发生机制与人类相同，但饲养条件高，育种周期长，遗传性不稳定、易变种，延长了实验周期。(3)应用一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)因子诱导模型[7]，或携带人重组缺氧诱导因子1α(HIF-1α)蛋白的腺病毒[8]，诱导孕鼠特异性产生PE样症状。但并未报道肾脏、胎盘等脏器的病变情况，且药物本身对胎鼠有毒性作用，可能干扰PE重要指标的准确性。(4)通过低氧、惊吓、生活环境拥挤等物理方法，持续刺激孕鼠，诱发PE症状[9-10]；但未报道胎盘滋养细胞的侵噬情况及肾脏小血管损伤程度。

表3 三组胎仔体重及胎盘湿重比较Table 3 Comparison of fetal weight and placental wet weight among the three ± s)

注：与假手术组相比，aP<0.05。

Note. Compared with the sham operation group，aP<0.05.

3.2 RUPP改良手术造模法

本次实验PE造模的目的是用于后续药物试验，实验初始设计对孕鼠进行单纯RUPP手术造模，因后续研究需要灌药干预，因此另外设置了RUPP+灌水组作为空白对照，但实验的结果非常有趣，虽然单纯RUPP组与RUPP+灌水组均能出现高血压、蛋白尿等PE临床表现，但单纯RUPP手术血压增高并不稳定，有时甚至不能出现高血压，而RUPP+灌水组孕鼠则能稳定表现出高血压，且仔鼠FGR情况更明显。因此，我们认为这可以成为一种RUPP改良模型。分析其原因可能为：RUPP手术后，在子宫胎盘缺血模型基础上，每天灌胃对孕鼠造成压力，使孕鼠持续处于紧张状态，激活交感神经系统，交感神经系统过度刺激，去甲肾上腺素分泌增多，抗血管收缩因子分泌减少，所以能诱导出更明显的妊娠高血压症状，与 Takiuti等[9]及 Kanayama等[11]等研究相符合。

本研究另外一个发现是，虽然RUPP+灌水组孕鼠血压更高，但其24 h尿蛋白量并未见明显增高，是否与灌水后增加了血容量从而改善肾脏血流量有关？尚需进一步研究。但本研究显示，虽然RUPP+灌水组24 h尿蛋白量增加不明显，胎儿生长受限却更显著，而且胎盘湿重更低，说明灌水并不能改善子宫胎盘血流，RUPP手术机械性钳夹血管降低子宫灌注是非常有效的。

多年来，传统RUPP手术建立PE模型由于能较针对性地引起由于胎盘缺血缺氧导致的妊娠高血压，接近临床上PE的发生机制，加上未使用药物建模，可减少建模药物对实验结果的影响，相比其他建模方式人数较多选择，但其重复性受大鼠品系、遗传背景、实验室条件等影响因素较多[2,5,12-13]。本次实验的结果显示，RUPP+灌水后能更稳定地构建PE模型，为子宫胎盘缺血妊娠高血压造模提供了新思路。

3.3 不足之处

RUPP手术对孕鼠基本体质及实验室环境要求较高，且RUPP手术及颈动脉插管两次手术对孕鼠打击大，两次手术间隔时间短，孕鼠未完全恢复，令实验母鼠丢失率及胎仔吸收率较预期高。

临床公认的PE发病机制为：胎盘缺血缺氧，局部释放多种胎盘因子入血，引起全身小血管痉挛导致多脏器损伤。本实验只对孕鼠血压、蛋白尿及胎仔情况等临床表现进行了研究，并未关注孕鼠血液中的炎症介质含量及子宫以外其他脏器受损情况，能否模拟出临床公认的PE发病机制有待进一步研究。