葡萄籽原花青素对碘海醇所致HK-2细胞凋亡的保护作用及其机制研究

单微微，翟志红，丁玉松，王 忠

随着现今介入诊断及治疗的广泛普及，造影剂(contrast media,CM)的使用日益频繁。在其应用过程中，所发生的无其它原因的急性肾功能损害称为造影剂肾病(contrast-induced nephropathy,CIN)，目前显著增多的CIN已成为医源性急性肾损伤的第三大原因[1-2]。人们对CIN的防治进行了大量的研究，并取得了一些进展，但在现实世界中的临床获益并不尽人意[3]。鉴于此，寻找更为有效的预防和治疗CIN的药物显得意义重大。CIN的发病机制尚不十分明确，目前一致认为CM对肾小管上皮细胞的直接毒性和其所致的氧化应激是CIN发生和发展的主要机制[2,4]。近年来许多研究[5]证实核因子E2相关因子2(Nuclear factor elytroid 2-related factor，Nrf2)在肾脏疾病的防治中具有重要生理学作用，激活Nrf2信号通路能有效提高机体的抗氧化应激和抗损伤能力。目前葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidin extracts，GSPE)被认为是天然的Nrf2活化剂，其可激活Nrf2信号通路，从而发挥对机体的保护作用[6-7]，而GSPE能否通过 Nrf2信号通路预防CIN却未有报道。该研究通过体外细胞实验观察GSPE对碘海醇所致的HK-2细胞凋亡损伤的保护作用，并探讨其保护作用的相关机制，以期对CIN防治的深入研究提供可行的方法。

1 材料与方法

1.1 细胞、药品与试剂HK-2细胞(上海富衡生物科技有限公司，货号：FH0228)；胎牛血清(以色列BI公司，货号：BISH0798)；DMEM/F12培养基(美国GIBCO公司，货号：8118125)；碘海醇(中国通用电气有限公司)；GSPE(天津尖峰天然产物研究开发有限公司，纯度>95.0%，批号：G050412)；Annexin V-FITC/PI双染试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司，货号：AP101)；ROS检测试剂盒(南京建成生物技术研究所，货号：E004)；CCK-8试剂盒(货号：AR1160-500)，HRP标记羊抗兔二抗(货号：BA1054)，兔多抗Nrf2、NQO1、HO-1抗体(货号：BA3790、BM4978、BM4010)，兔单抗Keap1、Bcl-2、Bax(货号：BA4497-2、PB3217、PB3351)(武汉博士德生物工程有限公司)；兔多抗caspase-3、兔单抗GAPDH(美国CST公司，货号：#5174)；鼠单抗β-actin、HRP标记羊抗小鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：TA-09、ZB-2305)；总RNA抽提试剂TRIzol(美国Ambion，货号：15596-026)；反转录试剂盒(日本TaKaRa，货号：RR037A)；QuantiNova SYBR Green PCR 试剂盒(德国QIAGEN，货号：Q111-02)。实时荧光定量PCR仪(美国ABI，型号：Quant Studio 6)；紫外分析仪(北京君意东方电泳设备有限公司，型号：JY02S)。

1.2 检测指标和方法

1.2.1细胞培养与分组 用DMEM/F12培养基+10%的胎牛血清配成的完全培养基培养HK-2细胞，在细胞孵育箱中37 ℃、5%CO2环境中孵育。生长至亚融合状态时换为无血清培养基同步12 h后根据分组给予不同处理。实验分为4组：① 对照组：细胞正常培养30 h；② 碘海醇组：细胞正常培养24 h后+碘海醇(100 mgI/ml作用细胞6 h)；③ GSPE+碘海醇组：GSPE(15、30、60 μmol/L浓度)与细胞共培养24 h后，加碘海醇(100 mgI/ml)作用6 h；④ GSPE组：GSPE(15、30、60 μmol/L浓度)与细胞共培养30 h。

1.2.2细胞增殖/毒性检测法(CCK-8)测定细胞活力 细胞均匀接种于96孔板，每孔接种5×103个细胞，每组设5个复孔。按以上分组处理细胞后，吸弃板孔中上清液，每孔加入含10% CCK-8的培养基100 μl，继续培养l.5 h，后取含10% CCK-8的培养基100 μl加入没有细胞的孔作为阴性对照。用酶标仪在450 nm波长下测定各孔吸光度(A)值。计算细胞存活率(%)=[(实验组A值-阴性对照组A值)/(对照组A值-阴性对照组A值)]×100%。

1.2.3DCFH-DA荧光结合流式细胞法检测细胞内ROS 细胞均匀的接种于六孔板，每个组平行设3个复孔，按各组要求处理细胞后把板内细胞培养液移除。用无血清培养基稀释DCFH-DA，使终浓度为10 μmol/L。于六孔板中每孔加入稀释好的DCFH-DA 1 ml，后孵育30 min～1 h。取出细胞培养板用PBS洗涤细胞3次，充分除去未进入细胞内的DCFH-DA。消化细胞，收集、离心后用PBS洗涤，再用PBS重悬，流式细胞仪检测。

1.2.4流式Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡率 细胞均匀接种于六孔板，每孔2×105个细胞，每个组平行设3个复孔，待细胞长至良好状态时，按以上分组处理细胞。后用不含EDTA的胰酶消化(操作要轻柔，且尽量少吹打细胞)、离心。后用PBS洗涤细胞1次，以尽可能去除残留的培养基。然后离心，吸弃PBS，再根据Annexin V-FITC/PI双标记法试剂盒说明书进行操作，后流式细胞仪检测。

1.2.5Western blot 法检测HK-2细胞Nrf2、Keap1、NQO1、HO-1和Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达 细胞均匀接种于六孔板，每个组设3个复孔，按各组要求处理细胞后，把板内细胞培养液移除，用PBS液轻柔地洗涤细胞3次。后置于冰上操作，每孔加预冷的细胞裂解液150 μl，裂解20 min，后用刮刀将细胞刮下，收集、离心，取上清液，测蛋白浓度并配平。每份样本取等量蛋白加入上样缓冲液，煮沸10 min变性，凝胶电泳分离，于转膜溶液中将蛋白转移至ECL专用PVDF膜上，室温下摇动封闭2 h，一抗4 ℃ 孵育过夜，后洗去多余一抗，二抗室温下孵育l～2 h，然后洗去多余二抗。显色曝光，分别以GAPDH和β-actin作为内参并作相对量分析。

1.2.6实时荧光定量PCR测定细胞内Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA的表达 细胞均匀接种于六孔板中，每个组设3个复孔，按各组要求处理细胞后，把板内细胞培养液移除，用预冷的PBS轻柔地洗涤细胞3次。后TRIzol法提取HK-2细胞内总RNA，后用TaKaRa反转录试剂盒将提取的总RNA进行逆转录。以逆转录后的cDNA为模板，β-actin为内参，在实时荧光定量PCR仪上对Nrf2、HO-1、NQO1基因进行荧光定量PCR扩增，所用引物序列见表1。反应条件：50 ℃、2 min，95 ℃、10 min；95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，40 个循环。用相对定量分析公式2-△△Ct，计算基因相对表达量。

表1 实时荧光定量 PCR 所用引物序列

2 结果

2.1 各实验组细胞存活率与对照组相比，碘海醇组细胞存活率明显降低(P<0.01)。与碘海醇组相比，GSPE+碘海醇组细胞存活率呈GSPE剂量依赖性升高，见表2。

2.2 各实验组细胞凋亡率与对照组相比，碘海醇组细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。与碘海醇组相比，GSPE+碘海醇组细胞凋亡率呈GSPE剂量依赖性降低，见图1、表3。

2.3 各实验组细胞内ROS水平与对照组比较，碘海醇组ROS水平显著升高(P<0.01)。与碘海醇组比较，GSPE+碘海醇组细胞ROS水平呈GSPE剂量依赖性降低，见表3。

2.4 HK-2细胞相关蛋白的表达与对照组相比，碘海醇组Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达量有所增加，但差异无统计学意义(P>0.05)；凋亡相关蛋白 Bax 、Caspase-3的表达量增加，Bcl-2的表达量减少(P<0.05)。与对照组及碘海醇组相比，GSPE(60 μmol/L)+碘海醇组和GSPE(60 μmol/L)组Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达量均显著增加(P<0.01)。与碘海醇组相比，GSPE(60 μmol/L)+碘海醇组的Bcl-2蛋白表达量增多(P<0.05)，Caspase-3蛋白表达量降低(P<0.05)。Keap1的蛋白表达量各组间差异均无统计学差异意义(P>0.05)。见图2、3。

2.5 HK-2细胞内Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表达量与对照组相比，碘海醇组Nrf2、HO-1 、NQO1mRNA的表达有所增多，但差异无统计学意义(P>0.05)，而 GSPE干预后GSPE(60 μmol/L)+碘海醇组及GSPE(60 μmol/L)组Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA的表达上调，与对照组和碘海醇组相比差异有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表2 各实验组细胞存活率

与对照组比较：**P<0.01；与碘海醇组比较：#P<0.05

表3 各实验组细胞内ROS水平和细胞凋亡率

与对照组比较：**P<0.01；与碘海醇组比较：#P<0.05，##P<0.01

图1 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率

A：对照组；B：碘海醇组；C：GSPE(15 μmol/L)+碘海醇组；D：GSPE(30 μmol/L)+碘海醇组；E：GSPE(60 μmol/L)+碘海醇组；F：GSPE(60 μmol/L)组

表4 HK-2细胞内Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA的相对表达量

与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，与碘海醇组比较：#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

已有的研究表明：CM对HK-2细胞具有直接毒性并能加重其氧化应激程度，最终引起HK-2细胞的凋亡、坏死[4,8]。在本实验中用第二代造影剂碘海醇(100 mgI/ml与HK-2细胞共培养6 h)[9]干预体外培养的HK-2细胞，同样观察到了细胞活力明显降低，细胞凋亡率和细胞内ROS含量明显升高。细胞内过量ROS的产生可引起并进一步加重细胞凋亡损伤，ROS参与调控的细胞凋亡与凋亡相关基因p53所介导的信号通路有关[10]，过量的ROS使p53磷酸化，p53是Bcl-2基因家族中细胞凋亡促进蛋白Bax和凋亡抑制蛋白Bcl-2的上游调节基因，当磷酸化的p53与Bax基因启动子中p53的结合位点结合后，使Bax的表达上调，Bcl-2的表达下调，这两种功能互相对立的蛋白间的比率关系是决定细胞存亡的关键[11]。Bax的过度表达还能促进线粒体内前凋亡分子Cyt-C和凋亡诱导因子的释放，进而活化下游的Caspase-3蛋白酶 ，介导细胞凋亡[12]。本实验中碘海醇使HK-2细胞内Bax和Caspase-3蛋白含量增多，Bcl-2蛋白含量下降，Bcl-2/Bax小于1，因此细胞凋亡增多。

相比于碘海醇对HK-2细胞的不良影响，在本实验中不同浓度的GSPE皆可拮抗碘海醇所致的细胞活力降低，抑制碘海醇诱导的细胞内ROS 升高，降低碘海醇所致的细胞高凋亡率，且在一定剂量范围内具有浓度依赖性。同时GSPE亦使HK-2细胞内Bcl-2蛋白含量增多，Bax和Caspase-3蛋白含量下降，Bcl-2/Bax大于1。说明GSPE对碘海醇所致的细胞凋亡具有保护作用。

图2 Nrf2信号通路相关蛋白的表达

A：对照组；B：碘海醇组；C：GSPE(60 μmol/L)+碘海醇组；D：GSPE(60 μmol/L)组；与对照组比较：**P<0.01；与碘海醇组比较：##P<0.01

图3 凋亡相关蛋白的表达

A：对照组；B：碘海醇组；C：GSPE(60 μmol/L)+碘海醇组；D：GSPE(60 μmol/L)组；与对照组比较：*P<0.05；与碘海醇组比较：#P<0.05，##P<0.01

由于Nrf2信号通路是机体主要的抵御外源性刺激和毒物的抗氧化应答反应的核心转录因子通路，已经明确其在细胞凋亡中发挥十分重要的作用。其激活的方式主要是Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)的解偶联，Keap1是Nrf2的抑制物，锚定Nrf2于胞浆中处于非活性状态而被降解，当胞浆中的Keap1与Nrf2解偶联，活化的Nrf2才能进入细胞核，与抗氧化基因启动子序列结合，调控抗氧化酶、Ⅱ相代谢酶的转录活性，进而发挥抗氧化损伤作用[13]。Nrf2与Keap1解偶联的发生主要是Keap1构象的改变，由于Keap1蛋白上富含电敏感半胱氨酸结构，在氧化应激或亲电子物质刺激下这些半胱氨酸变异，进而导致Keap1构象的变化，Nrf2与Keap1解偶联，Nrf2的降解减少。在本研究中GSPE提高了HK-2细胞内Nrf2基因的表达量和蛋白含量，而不上调Keap1的蛋白表达量，说明GSPE有可能导致了Keap1构象的变化而激活其调控通路。

细胞抗氧化损伤作用的发挥，胞内ROS的降低与Nrf2调节的下游Ⅱ相代谢酶NQO1、抗氧化酶HO-1的表达密切相关，它们可通过催化醌、氮氧化合物等的双电子还原来减轻氧化损伤。Jena et al[14]发现虾青素能增加HO-1和NQO1的表达量，明显降低环磷酰胺诱导的肝细胞的氧化应激。黄存东 等[15]研究表明激活Nrf2/HO-1信号通路能保护细胞免受氧化应激的损伤。本实验结果中，GSPE干预组与对照组和碘海醇组相比NQO1和HO-1 基因表达和蛋白的含量均显著增高，这表明GSPE能通过激活Nrf2信号通路上调了其靶基因表达，从而增强了细胞对不良刺激的抗性。

综上，GSPE对碘海醇所致的HK-2细胞的凋亡损伤具有明显的保护作用，其保护作用可能是通过激活Nrf2信号通路而实现的。GSPE作为一种纯天然物质有很大的开发应用前景，基于该研究，在未来GSPE可能用于CIN的预防和治疗。