精子DNA碎片对IVF和ICSI中囊胚形成的影响

梁晓东,段如冰,莫淦文,沈炳连,纪 鹏,廖勇彬

广东省江门市中心医院生殖医学诊疗中心,广东江门 529030

精子DNA碎片指的是精子成熟过程中在各种因素的作用下,其DNA片段发生断裂、交联等损伤。当这种存在碎片的精子数量超过一定程度,可能导致男性不育。而这种精子DNA损伤导致的男性不育通常无法通过常规的精液分析检查出来,成为不明原因不育[1]。近年来,辅助生殖技术(ART)的广泛应用为患者带来了孕育新生命的希望。在应用ART治疗过程中,这些患者的预后与结局受到高度的重视。有研究表明,精子DNA损伤与反复的胚胎质量差、种植失败及流产存在密切的关系[2],但对于精子DNA损伤通过何种途径影响妊娠结局,以及影响胚胎发育的哪个阶段,目前仍然没有统一的结论。近年来,把第3天(D3)的胚胎培养成为囊胚,再移植到子宫内膜的技术受到生殖界的青睐,囊胚具有种植率高,与子宫内膜移植窗口期更为同步等优点,成为实验室开展囊胚培养的着眼点。使用囊胚培养更是能准确地反映和评估胚胎发育潜能的重要手段[3]。已经有学者对精子DNA碎片是否会影响到胚胎的发育潜能或者影响到卵裂期胚胎发育成囊胚进行了研究[4-5]。这些研究主要使用单因素分析法,鉴于影响囊胚形成的影响因素众多,仅使用单因素进行分析有可能造成偏倚,因此,有必要进一步使用多因素分析法分析各因素对囊胚形成的影响,从而观察DNA完整性对囊胚形成结局的独立作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾分析2016年1月至2018年12月在本院生殖医学诊疗中心行囊胚培养周期的患者夫妇资料。纳入标准:女方年龄≤35岁,受精方式包括常规体外受精(IVF)和单精子卵浆内注射技术(ICSI)。排除标准:(1)经皮附睾/睾丸穿刺取精(PESA/TESA)周期；(2)女方卵巢储备功能低下,参照ZHANG等[6]介绍的标准,基础窦卵泡数<5个,或者基础促卵泡生成素(FSH)>10 U/L,或者曾经出现过前一个卵巢刺激周期获卵数<5个的卵巢低反应史；(3)卵母细胞冷冻周期。

1.2方法

1.2.1促排卵方案 在促排卵的前1个月经周期的黄体中期开始用促性腺释放激素激动剂(GnRH-a)进行降调。用GnRH-a后16～20 d,达到降调标准后使用促性腺激素(Gn)启动,同时B超监测卵泡发育,并测量血清性激素水平,当至少1个卵泡直径达18 mm或至少3个卵泡直径达17 mm时,注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)。注射HCG后34～36 h取卵。

1.2.2精液采集及处理 男方禁欲3～5 d,取卵日用手淫法收集精液。使用上游法或密度梯度离心法处理精液。

1.2.3IVF和胚胎培养 取卵术后,收集和观察卵母细胞形态,根据处理后精子数量选择IVF方案或者ICSI方案进行受精。若受精率低,则采取补救卵胞浆内单精子注射(R-ICSI)方案。受精72 h后观察D3胚胎情况。

1.2.4囊胚培养 采用Quinn′s Adavantage序贯培养液或Vitrolife序贯培养液对卵裂期胚胎作囊胚培养,按试剂说明书操作。第5天(D5)上午进行观察,若当天形成可用囊胚则移植,若未形成则在第6天(D6)再观察,若有可用囊胚形成再移植。囊胚的评价标准采用Gardner人类囊胚分级系统,D5评分≥3BB、D6评分≥4BB定义为优质囊胚,D5评分>3CC、D6评分>4CC定义为可用囊胚。

1.2.5精子染色质结构分析试验(SCSA)检测精子DNA碎片指数(DFI) 精液液化后用TNE(Tris,NaCl,EDTA)缓冲液进行稀释,使精子浓度为(1～2)×106/mL,取0.05 mL稀释后的悬液置于流式细胞仪进样管中,加入0.1 mL酸处理液处理30 s,再加入0.3 mL吖啶橙染色液,调整精子流速。检测5 000个精子的荧光,用软件分析各种荧光的精子比例,并且计算出DFI。

2 结 果

2.1患者夫妇一般资料 符合条件的患者夫妇的基础情况见表1。

2.2各组囊胚培养结果 各组的囊胚形成状况见表2。随着DFI的升高,囊胚形成率、可用囊胚形成率和优质囊胚形成率呈现下降趋势。

表1 患者的基础条件和获卵数

表2 各组囊胚培养结果

注:-表示无数据。

2.3多因素回归分析 把DFI和能够影响囊胚形成率的其他变量,如女方基础条件、授精方法，以及男方精子浓度、活力及形态等作为协变量,把是否形成囊胚作为因变量进行Logistic多因素回归模型分析,在模型中把有囊胚形成设定为1,没有形成囊胚设定为0；把不孕因素中的男方因素设定为1,女方因素设定为2,双方因素设定为3,其他因素设定为4；把授精方法中的IVF设定为1,ICSI设定为2,R-ICSI设定为3。结果提示精子活力、DFI和授精方式与囊胚形成结局显著相关(P<0.05),见表3。

表3 囊胚形成多因素Logistic回归分析

注:-为无数据。

3 讨 论

精子DNA片段发生损伤是外界理化因素及内在精子缺陷共同作用的结果[7]。较高的精子DNA损伤率可以引起男性不育[8]。而随着生殖医学技术的发展和进步,不少不孕不育夫妇接受ART而成功妊娠,因此,精子DNA损伤程度对于采取了ART治疗后的临床结局及预后是否也存在着影响,是一个重要的研究课题。目前，已经有大量的研究表明,精子DNA损伤与不良的IVF妊娠结局有密切关系[4，9]。

胚胎的体外培养是IVF过程中至关重要的一环,胚胎的质量直接影响妊娠结局。利用卵裂期胚胎培养至囊胚阶段,观察其是否形成囊胚或者囊胚是否可用,比起单纯的对卵裂期胚胎进行形态学评估,更能客观、准确地反映胚胎的质量与发育潜能[3]。因此,本研究通过观察囊胚培养结局作为胚胎发育潜能指标来研究精子DNA损伤对其的影响。研究发现,随着精子DNA损伤程度的升高,囊胚形成率、可用囊胚形成率和优质囊胚形成率呈现下降趋势,表明精子DNA碎片能影响卵裂期胚胎发育到囊胚的过程,与VIRRO 等[10]和NI等[5]的研究结果相同。SIMON等[11]把这种影响称为胚胎晚期发育的父源效应。

先前已经有研究报道了精子DNA碎片对囊胚发育的影响[12],然而由于女方年龄、卵巢储备功能及使用的授精方法也可能影响到囊胚形成结局[13-14],对研究结论造成干扰。为此本研究不但选取了年龄35岁以下、卵巢储备功能好的女性患者作为研究对象,还把这些因素及授精方法等变量纳入Logistic多因素回归模型进行分析，结果显示,囊胚形成与授精方式有关,与唐永梅等[15]的研究相符合。除此以外,从模型分析结果还可以看出,男方精液参数中的精子活力也能影响囊胚形成,可能与精液处理过程中所选择的方法有关[16]。综合分析以上因素及模型分析结果,笔者认为DFI是囊胚形成过程中的重要影响因子。

精子DNA损伤能够广泛地影响胚胎细胞各个发育过程,包括受精、细胞分裂、胚胎发育和着床过程。带有DNA损伤的精子与卵母细胞受精后,卵母细胞会以有限的修复能力启动DNA修复程序,但严重的DNA损伤卵母细胞无法修复,可能会激活凋亡通路,诱导胚胎凋亡,以上机制可能是影响胚胎发育潜能的重要机制之一[17]。

综上所述,本研究探讨了精子DNA完整性对囊胚形成的影响,可为今后深入研究精子DNA完整性对囊胚形成的预测价值及作用机制奠定基础。