机体抗结核分枝杆菌感染的主要免疫细胞及其作用机制

胡晓光 陈灿灿 张亚男 马俊扬 陈伟

结核分枝杆菌(MTB)通过多种机制逃避和破坏宿主的细胞免疫反应，使其能在宿主体内持续建立感染。但是，目前尚不完全清楚机体对MTB复杂的细胞免疫过程。人类免疫缺陷病毒(HIV)感染是结核病进展的最大风险因素之一[1]，并发HIV感染使潜伏结核感染(LTBI)进展成为活动性结核病(ATB)的风险从5%～10%的终生风险提高到10%的年风险。

卡介苗(BCG)在预防儿童和成年人肺结核方面效果不稳定[2]，且免疫学机制尚不完全清楚。此外，长期以来关于理想结核病疫苗的观点认为，结核病疫苗的免疫反应本质应该是刺激机体产生抗原特异性CD4+T淋巴细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)[3]。随着近年来对宿主感染MTB后产生免疫反应的了解不断加深，利用MTB感染免疫学的知识改进结核病治疗方法和疫苗的机会也在增加。提高对MTB与宿主免疫细胞之间复杂的相互作用的认识，对于开发有效的结核病疫苗至关重要。

一、MTB抵抗巨噬细胞的吞噬作用

巨噬细胞是感染过程中最先遇到MTB的免疫细胞，也是结核病的主要宿主细胞。巨噬细胞识别MTB后将其吞噬并将细菌隔离在吞噬体中，吞噬体通常通过与溶酶体融合后酸化来消灭病原体。然而，MTB能够通过多种机制抑制吞噬体成熟和吞噬溶酶体生成，从而在吞噬体中存活和增殖[4]。

MTB糖脂可以阻止磷脂酰肌醇3-磷酸(PI3P)在吞噬体膜上的累积，并阻止吞噬溶酶体的形成[5]。MTB还可以分泌磷酸酶(SapM和PtpA)和丝氨酸/苏氨酸激酶(PknG)干扰吞噬体成熟[6]。MTB的ESX-1分泌系统也可以破坏宿主细胞吞噬体的完整性，从而阻止吞噬体成熟[7]，ESX-1介导的噬菌体逃逸被认为是通过结核分枝杆菌早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)破坏噬菌体而发挥逃逸作用[8-9]。MTB的ESX-3分泌系统还可以通过抑制转运所需的宿主内吞体分选复合物，参与调节细胞内细菌的转运，以抑制吞噬体成熟[10]。以上研究表明，ESX分泌系统在细菌逃避吞噬体方面可能能够发挥作用。除了ESX系统，MTB还能表达参与蛋白分泌的2个SecA atp酶同源蛋白SecA1和SecA2[11]，MTB和BCG的ΔsecA2突变体都能缩短宿主细胞吞噬体的酸化时间，表明SecA2是抑制吞噬体成熟的必要条件[12]。

MTB通过不同的受体进入巨噬细胞，可导致抑制或促进细菌增殖的不同途径被激活。例如，补体受体3(CR3)对MTB的吸收依赖于宿主胆固醇，而胆固醇通过激活宿主钙调蛋白[13]，介导与吞噬体和冠蛋白-1的结合及一氧化氮合酶2(NOS2)信号基因转录，产生一氧化氮(NO)[14]。宿主体内NO的水平与机体抗结核作用密切相关，在小鼠模型中NO抗结核作用的证据更充分。在小鼠中，活性氮中间体(RNI)在体外对分枝杆菌具有毒性[15]，抑制一氧化氮合酶(NOS)会导致感染加重。虽然在人类肺泡巨噬细胞和原代单核细胞的体外研究中没有发现NO的抗分枝杆菌作用[16]，但与健康对照人群相比，结核感染者体内NOS2表达明显上调[17]。

二、MTB感染中自然杀伤(NK)细胞的作用

NK细胞是具有分泌IFN-γ和溶细胞功能的先天淋巴细胞。MTB细胞壁的各种成分可直接与NK细胞上的NKp44受体结合[18]。NK细胞本身不表达特异性抗原识别受体，但可通过识别MTB感染的细胞表面表达上调的受体分子(如MHC Ⅰ类分子)，从而直接杀伤感染的靶细胞[19]。NK细胞可直接杀死已感染MTB的巨噬细胞[20]，但还可以通过分泌白细胞介素(IL)-22和IFN-γ限制细胞内细菌的增殖[21]。此外，NK细胞可以通过提高CD8+T淋巴细胞产生IFN-γ的水平[22]，促进γδT细胞的增殖[23]，间接增强对MTB的免疫力。接种BCG后，机体IL-21依赖的NK细胞亚群在MTB感染后出现上调的现象[24]，表明NK细胞可能也具有记忆细胞的一些显著特征。

三、MTB感染人群炎症期间肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的作用

中性粒细胞的聚集和活动可以帮助抑制细菌增殖，但是持续的中性粒细胞炎症又可以破坏炎性反应的平衡，从而促使疾病进展。在小鼠模型和人类样本中，过量的Ⅰ型干扰素信号已被证明会促进疾病的发生。Ⅰ型干扰素在MTB感染的致病作用包括抑制IL-1β[25]、IFN-γ对巨噬细胞的激活作用。

TNF-α是在抗结核免疫过程中至关重要的促炎细胞因子。机体TNF-α水平较低会表现出高度的结核易感性[26]。并发炎性疾病的LTBI人群在接受抗TNF-α治疗炎性疾病后，LTBI向ATB进展的速度加快[27]，体现了TNF-α在抗结核过程中的关键免疫作用。小鼠感染MTB的组织病理学证据表明，TNF-α信号缺失对调节感染后细胞凋亡或坏死作用产生了影响[28]。

炎症的调控是决定结核感染结局的关键因素。过度的炎症会损伤细胞免疫过程，导致肺组织病理损伤。相反，炎症反应不足会导致先天和适应性免疫诱导延迟，从而损害对细菌的免疫控制力。

四、MTB感染后CD4+ T淋巴细胞的主要作用

CD4+T淋巴细胞的水平是决定MTB感染后结局的一个关键因素。但是与其他病原体相比，MTB感染特异性CD4+T淋巴细胞反应通常在感染后2～3周才能被检测到[29]，这种适应性免疫的启动延迟可能是由多种因素引起的，包括细菌生长缓慢，感染的巨噬细胞和中性粒细胞的凋亡受到抑制，以及巨噬细胞的激活和迁移延迟，这些因素同时也会导致MTB在肺部建立持续感染。

CD4+T淋巴细胞与感染的巨噬细胞相互作用，抑制细胞内MTB复制。CD4+T淋巴细胞反应的有效性取决于抗原特异性CD4+T淋巴细胞从淋巴组织转移到感染肺组织中的水平。

有研究证明，感染期间肺血管系统的细胞分泌的IFN-γ量最高[30]。还有研究表明，IFN-γ可以控制肺脏蔓延至脾脏的细菌负担，同时IFN-γ的过表达又会加重免疫病理损伤[31]，提示IFN-γ有抑制细菌向肺外传播的作用，但IFN-γ过表达也会对机体产生损伤。李美忠等[32]研究表明，CD4+T淋巴细胞的一个亚群——多功能辅助性T细胞(Th1)，其分泌的IFN-γ、IL-2等细胞因子在控制慢性感染中能够发挥重要作用，Th1亦可作为评价疫苗接种效果的参考指标。

综上所述，抗原特异性CD4+T淋巴细胞在对MTB的保护性免疫中发挥重要作用。

五、CD8+ T淋巴细胞在抗MTB感染中的作用

CD8+T淋巴细胞在抵抗MTB感染的免疫中同样发挥着重要作用。与对照组相比，缺乏抗原加工转运相关蛋白(TAP-1)的小鼠在感染MTB后，因小鼠CD8+T淋巴细胞反应缺陷而迅速死亡[33]。动物实验表明，CD8+T淋巴细胞的耗竭会减弱BCG疫苗或化学干预措施的保护性免疫效果[34]，这表明CD8+T淋巴细胞是MTB感染免疫反应的重要组成部分。同样，在化学药品治疗结核潜伏感染的小鼠模型中，CD8+T淋巴细胞可以抑制MTB的再激活[35]。CD8+T淋巴细胞在抗MTB感染过程中的作用与其分泌可抑制细菌增殖的细胞因子和细胞溶解效应分子有关。除了IFN-γ和TNF-α外，CD8+T淋巴细胞还可分泌穿孔素来裂解已感染MTB的巨噬细胞[36]。CD8+T淋巴细胞也可以释放颗粒溶菌素，直接杀死细胞内的MTB[37]。类风湿关节炎患者使用抗TNF-α疗法会消耗部分CD8+T淋巴细胞，这种现象部分解释了为什么接受抗TNF-α治疗的LTBI进展到ATB的风险会增加。另外，MTB的抗原——培养滤液蛋白10(CFP-10)[38]、ESAT-6[39]和Ag85复合体[40]能与人CD8+T淋巴细胞受体结合，激活免疫反应，但是结合位点集中于有限的一些抗原表位，通常受人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)-B等位基因限制[41]。感染MTB的巨噬细胞凋亡可以促进MTB抗原向CD8+T淋巴细胞交叉呈递。然而MTB可以抑制宿主细胞凋亡，以逃避CD8+T淋巴细胞诱导的有效应答。

综上所述，CD8+T淋巴细胞是MTB感染适应性免疫的关键组成部分，并通过抑制潜伏期感染的再激活，以及在活动期间直接参与抗菌过程发挥重要作用。

六、记忆T细胞免疫反应

在LTBI和治愈的结核病患者中可以检测到抗原特异性记忆T细胞反应。记忆T细胞亚群可以通过其细胞表面表型和功能特性进行识别，而抗原特异性记忆T细胞的不同群体可以根据其一系列细胞表面激活标志物和趋化因子受体的表达进行分类[42]。LTBI中MTB特异性记忆CD4+T淋巴细胞大部分是CD45RA-CCR7-表型的T效应记忆细胞[43]。LTBI个体进行MHC Ⅱ类四聚体观察分析显示，与健康对照组相比，LTBI的CD45RA-CCR7+中央记忆CD4 细胞表面趋化因子受体CXCR3、CCR6表达量增加[44]，显示出CXCR3、 CCR6 受体在MTB感染时的特异性。

记忆CD4+T 淋巴细胞表型可能会根据抗原特异性、疾病状态及识别特异性反应的方式而有所不同。在LTBI个体中，人类记忆CD8+T淋巴细胞主要是末端分化的效应记忆T细胞[45]。免疫记忆的小鼠T细胞在MTB感染后早期迅速增殖并分泌IFN-γ，虽然表现出明显的保护效应但是保护周期较短[46]，表明原发性MTB感染后产生的记忆T细胞保护其免受再次感染的能力有限。

七、MTB感染期间的B细胞反应

有研究表明，体液免疫在抵抗MTB感染中起着重要作用[47]。在人肉芽肿的淋巴细胞中可以发现B细胞与T细胞并存[48]，全血基因表达分析显示，结核病患者在抗结核治疗后，B细胞相关基因发生了明显变化[49]。人体外和小鼠感染模型试验也显示抗体能提供一定的保护作用[50]。利用高通量方法鉴定MTB蛋白质组中的抗体靶标揭示了活动性肺结核患者血浆中存在抗体识别的细胞外抗原[51]，表明B细胞积极参与了MTB感染后的免疫。MTB感染后，B细胞缺陷小鼠的嗜中性粒细胞聚集量增加并加重了肺部病理损伤[52]，这是由于B细胞缺陷或B细胞耗竭的小鼠IL-17反应增强介导的[53]。这些研究表明，B细胞可通过调节炎症反应来影响MTB感染的结局。抗体与B细胞表面抑制性受体FcγRⅡ-B的结合会减弱巨噬细胞产生IL-12并抑制Th1细胞的作用[54]，而将针对MTB细胞壁成分的单克隆抗体转移至小鼠体内可以改善小鼠感染的结局[47]。

综上所述，B细胞通过调节抗体和细胞因子的分泌来调节炎症，从而在MTB感染的适应性免疫应答中发挥作用。

八、γδT细胞对MTB的免疫反应

γδT细胞是T细胞的一种亚群，可识别非肽抗原，如微生物代谢产物和磷抗原[55]，存在于包括肺在内的黏膜表面[56]。MTB感染单核细胞后可以激活γδT细胞的增殖[57]。人的γδT细胞可识别多种MTB代谢产物，包括焦磷酸盐、异戊二烯基焦磷酸盐衍生物和含三磷酸胸苷的化合物[58]。γδT细胞也可以对分枝杆菌热休克蛋白产生反应[59]，接种BCG也可引起类似反应[60]。表达Vγ9Vδ2受体的γδT细胞占外周血中MTB反应性T细胞的很大比例[61]，并且可以限制巨噬细胞中细胞内MTB的增殖[62]。此外，人Vγ2Vδ2 T细胞可识别MTB[63]，在非人灵长类动物中，Vγ2Vδ2 T细胞可被磷抗原和IL-2刺激而增殖[64]。有研究表明，γδT细胞可通过分泌颗粒溶素和穿孔素或通过单核细胞诱导TNF-α介导直接杀死MTB[65-66]。

九、结核病并发HIV感染后T细胞功能受损

MTB的传播受到多种因素的影响，包括与ATB患者的接触程度和接触时间，以及感染者自身的免疫力[67]。大多数人在接触MTB后转变为LTBI者，其中有5%～10%的LTBI者会发展为ATB。MTB感染的临床诊断与治疗常伴随多种感染而导致复杂化。

HIV感染机体后，CD4+T淋巴细胞衰竭和功能障碍导致机体对MTB的免疫受到抑制。多项研究表明，结核病患者特异性T淋巴细胞的耗竭可能是CD4+T淋巴细胞中HIV的辅助受体，尤其是趋化因子受体CCR5表达增强的结果[68]。并发巨细胞病毒(CMV)感染的LTBI个体，MTB特异性CD4+T淋巴细胞分泌巨噬细胞炎性蛋白-1β(MIP-1β)水平上升，而并发HIV感染的LTBI个体中，MTB特异性CD4+T淋巴细胞分泌水平明显上升的细胞因子却是IL-2[69]。对并发HIV感染的LTBI患者病毒载量的分析表明，病毒载量与分泌IL-2的MTB特异性CD4+T淋巴细胞的频率呈负相关[70]，进一步说明产生IL-2的MTB特异性CD4+T淋巴细胞在并发HIV感染的情况下可能被特异性消耗。与此相关的是，与未感染HIV的LTBI者相比，感染HIV的患者CD4+T淋巴细胞的水平较低，而且增殖能力受损[71]，表明在HIV感染的过程中，MTB特异性CD4+T淋巴细胞功能发生障碍。此外，HIV感染可能会扰乱免疫细胞(如CD8+T淋巴细胞)对MTB的保护性免疫。据报道，与未感染HIV的个体相比，感染HIV的LTBI患者MTB特异性CD8+T淋巴细胞的增殖能力受损[72]。此外，MTB感染引起巨噬细胞分泌的TNF-α水平下降，更有利于HIV的增殖[73]。

综上所述，结核病并发HIV感染者细胞功能受损，打破了免疫系统平衡，导致T细胞清除MTB和HIV的能力进一步降低。

十、总结与讨论

通常情况下，大多数病原体在感染人体后，经过一系列的免疫反应，最终的结局是被人体内的巨噬细胞吞噬，接着被巨噬细胞内的溶酶体溶解，最终死亡。而MTB存在一种“免疫逃避”现象，能够保护MTB在被巨噬细胞吞噬后逃避溶酶体的溶解。“免疫逃避”的机制目前尚不完全清楚，除了本文提到的MTB抑制氧化应激和巨噬细胞凋亡的机制以外，还有可能与巨噬细胞对IFN-γ刺激应答的敏感度被下调有关[74]；MTB存在ESAT-6和CFP-10，可以在细胞膜表面形成保护层，影响特异性反应，从而保护MTB在巨噬细胞中不被溶解，从而得以增殖[75]。最近的研究发现，结核坏死性毒素(tuberculosis necrotizing toxin，TNT)可以水解巨噬细胞中一种重要的辅酶NAD+，导致巨噬细胞死亡，从而释放出MTB来感染更多的细胞[76]。以上研究或许可以为MTB的“免疫逃避”机制提供解释。

目前尚缺乏针对成年人的结核病疫苗，BCG可以预防婴幼儿发生重症结核病，但对于儿童或成年人的肺结核没有明显的保护作用。原因可能为：BCG不能预防原发感染，但却可以改变人体的防御机制，机体在接种BCG 4～8周后会产生免疫力，这种免疫力可以在机体感染MTB后，抑制其繁殖和播散。但是这种获得性免疫的持久性和MTB在体内的存活状况相关，随着体内MTB的消亡，机体的这种获得性免疫也会随着记忆性T淋巴细胞数量的减少及功能衰退而逐渐降低直至消失[77]，这种免疫被称为带菌免疫或传染性免疫[78]；另一方面，BCG在传代或去除毒力基因的减毒过程中，会使一些保护性抗原和免疫相关的基因丢失[79]，如Esx-1基因的缺失，可能是导致BCG在减毒的同时大大降低其保护效果的主要因素之一[80]。因此，BCG不能诱导终生免疫。目前世界范围内处于临床研究的结核病疫苗包括5种亚单位疫苗(AEC/BC02、M72/AS01E[81]、H4:IC31[82]、H56:IC31[83]和ID93/GLA-SE[84])、5种病毒载体疫苗(Ad5Ag85A[85]、MVA85A、ChAdOx1.85A/MVA85A[86]、MVA85A-IMX313[87]和TB/FLU-04L)，以及5种全细胞结核病疫苗(母牛分枝杆菌疫苗、DAR-901[88]、VPM1002、MTBVAC 和RUTI)。MVA85A是一种表达MTB的Ag85A抗原的安卡拉痘苗病毒，作为BCG的增效疫苗，虽然接种MVA85A增强了抗原特异性CD4+T淋巴细胞反应，但是最终结果未显示出保护效果[89]。此外，最近的一项利用重组巨细胞病毒(CMV)的结核疫苗研究结果显示出对恒河猴具有保护作用[90]。需要注意的是，人体以前接触过载体病毒可能会减弱疫苗诱导的免疫反应并可能出现并发症。VPM1002是一种提高BCG免疫原性的重组疫苗[91]；MTBVAC是一种基因减毒的MTB菌株，其phoP和fadD26基因的缺失破坏了MTB表面各种脂质的合成[92]；治疗性候选疫苗RUTI是在压力下将MTB灭活、破碎，去除有毒成分后放置于脂质体中制成的[93]；母牛分枝杆菌疫苗主要成分与MTB具有相同的免疫原性蛋白[94]，二者均能产生相应的特异性细胞和体液免疫，并存在交叉免疫反应[95]。

尽管越来越多的研究表明IFN-γ在抗结核过程中发挥重要作用，但是仅仅增强诱导IFN-γ的分泌不足以成为有效的结核病疫苗。研究证明，BCG诱导的特异性CD4、CD8和γ δ T细胞，与新生儿结核病的保护效果无相关性[96]。此外，由于约90%的MTB感染者在感染后处于潜伏状态，因此研发用于LTBI的疫苗也至关重要[97]。在缺乏结核病疫苗的情况下，实现“终止结核病”充满挑战，了解MTB打破先天性免疫和适应性免疫状态的机制，能为更好地开发新的结核病疫苗提供理论依据。

利益冲突本文内容仅为学术观点，不涉及利益冲突。