2种SARS-CoV-2 抗体检测方法在COVID-19诊断中的价值

胡 燕， 申 鸽， 李 琼， 曾紫嫣， 朱 攀， 杨 钢， 李 萍， 陈煜枫， 张 贞， 谢小兵

（1.湖南中医药大学第一附属医院医学检验与病理中心，湖南 长沙 410007；2.娄底市疾病预防控制中心，湖南 娄底 417000）

新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染引起，该病毒是之前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株[1-2]。《新型冠状病毒感染肺炎诊疗方案（试行第七版）》[3]将COVID-19确诊标准在原有核酸检测和测序的基础上增加了血清学检测，即“SARSCoV-2特异性IgM抗体和 IgG抗体阳性”或“SARS-CoV-2特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期升高4倍及以上”可确诊。目前，SARS-CoV-2抗体的检测方法主要有化学发光法、胶体金法、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等。本研究拟对化学发光法和ELISA检测血清SARS-CoV-2抗体的性能进行评价，探讨其在COVID-19诊断和大规模筛查中的价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2020年1—3月湖南中医药大学第一附属医院和娄底市疾病预防控制中心COVID-19确诊患者116例，其中男60例、女56例，年龄19～81岁。所有患者均符合《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》中的诊断标准。选取湖南中医药大学第一附属医院健康体检者90名和非COVID-19住院患者（包括呼吸内科、肿瘤科、结石科、血液病科、血透室、针灸推拿科等）256例作为非COVID-19组，其中男205例、女141例，年龄3～83岁。2个组之间年龄、性别差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究经湖南中医药大学第一附属医院医学伦理委员会批准，患者及其家属均知情同意。

1.2 入选及排除标准

COVID-19患者均有明确的流行病学接触史及COVID-19临床症状和/或肺部影像学特征，且呼吸道样本或粪便样本SARS-CoV-2核酸阳性。非COVID-19 组所有患者呼吸道样本SARSCoV-2核酸阴性，没有流行病学接触史，且均没有COVID-19临床症状和肺部影像学特征。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 由护士在三级防护下采集COVID-19患者确诊后1～7 d内的空腹静脉血5 mL，严格按标准操作流程密封转运至湖南中医药大学第一附属医院检验科。由护士采用真空采血管采集所有非COVID-19患者空腹静脉血5 mL，密封转运至湖南中医药大学第一附属医院检验科。所有样本均经1 200×g离心5 min，分离血清。

1.2.2 化学发光法检测血清SARS-CoV-2抗体 采用iFlash3000全自动化学发光免疫分析仪（深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司）及配套试剂（化学发光法）检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体。基本原理：采用基于直接化学发光技术的两步间接免疫法。样本中的SARS-CoV-2 IgM或IgG抗体与样本处理液中包被SARS-CoV-2抗原的磁珠结合，形成抗原-抗体复合物，然后用清洗液洗去未结合的物质，再加入吖啶酯标记的鼠抗人IgM抗体，形成抗原-抗体-二抗复合物，清洗后加入预激发液和激发液，测定相对发光强度（relative light unit，RLU）。样本中的SARS-CoV-2 IgM或IgG抗体水平与RLU呈正相关。仪器根据RLU及内置校准曲线自动计算出IgM或IgG抗体水平，以≥10.0 AU/mL为阳性。

1.2.3 ELISA检测血清SARS-CoV-2抗体 SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体ELISA试剂盒购自珠海丽珠试剂股份有限公司。检测仪器为ECAN200-8全自动酶免分析仪（瑞士帝肯公司）。基本原理：SARS-CoV-2 IgM 抗体采用捕获法检测。以抗人IgM μ链（包被二抗）包被微孔板，加入样本，如样本中存在IgM抗体，则会形成抗体-包被二抗复合物，洗涤后加入酶标记的重组SARS-CoV-2抗原（酶标抗原），形成酶标抗原-待测抗体-包被二抗复合物，洗涤后加入底物缓冲液和底物液，显色并终止反应。SARSCoV-2 IgG抗体采用间接法检测。以重组SARSCoV-2抗原（包被抗原）包被微孔板，加入样本，如样本中存在IgG抗体（待测抗体），则会形成待测抗体-包被抗原复合物。洗涤加入酶标记的抗人IgG抗体（酶标二抗），形成酶标二抗-待测抗体-包被抗原复合物。洗涤后加入底物缓冲液和底物液，显色并终止反应。SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体均以样本吸光度（A）值≥Cut-off值为阳性。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 化学发光法和ELISA检测血清SARS-CoV-2 IgG抗体性能比较

在116例COVID-19患者中，化学发光法检出105例，敏感性为90.52%；ELISA检出74例，敏感性为63.79%。在346例非COVID-19者中，化学发光法检出342例，特异性为98.84%；ELISA检出334例，特异性为96.53%。化学发光法和ELISA的阳性预测值分别为96.33%、86.05%，阴性预测值分别为96.66%、88.83%，准确性分别为96.75%、88.31%。化学发光法检测SARS-CoV-2 IgG抗体的敏感性、阳性预测值、阴性预测值及准确性优于ELISA（P＜0.05），而特异性2种方法之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 化学发光法和ELISA检测血清 SARS-CoV-2 IgM抗体性能比较

在116例COVID-19患者中，化学发光法检出88例，敏感性为75.86%；ELISA检出68例，敏感性为58.62%。在346例非COVID-19者中，化学发光法检出344例，特异性为99.42%；ELISA检出337例，特异性为97.40%。化学发光法和ELISA的阳性预测值分别为97.78%、88.31%，阴性预测值分别为92.47%、87.53%，准确性分别为96.86%、87.66%。化学发光法检测SARSCoV-2 IgM抗体的敏感性、阳性预测值、阴性预测值及准确性优于ELISA（P＜0.05），而特异性2种方法之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 2种方法SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体联合检测阳性率的比较

在116例COVID-19患者中，化学发光法和ELISA SARS-CoV-2 IgG抗体和IgM抗体联合检测的阳性率分别为100%（116/116）和68.97%（80/116）。在346例非COVID-19者中，化学发光法和ELISA 2种抗体联合检测的阳性率分别为1.16%（4/346）和 4.91%（17/346）。化学发光法2种抗体联合检测的敏感性优于ELISA（P＜0.05）。

3 讨论

自COVID-19疫情发生以来，SARS-CoV-2核酸阳性或基因测序结果与已知的SARS-CoV-2高度同源一直是COVID-19疑似病例的确诊标准。但SARS-CoV-2核酸检测易出现假阴性情况，导致核酸检测结果与患者临床症状、影像学检查结果不符，这给COVID-19的诊断及防控带来巨大的不便[4-5]。因此，《新型冠状病毒感染肺炎诊疗方案（试行第七版）》[3]将血清学抗体检测纳入COVID-19的确诊标准中。

目前，我国已有商品化SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测的试剂盒。由于 COVID-19为新发的传染病，抗体检测对于SARS-CoV-2感染的诊断来说是一个全新的方法，因此有必要对不同抗体检测方法的敏感性和特异性进行验证。有研究结果显示，采用化学发光法检测SARSCoV-2 IgM和IgG抗体有较高的敏感性和特异性[6]。然而，ELISA检测SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体目前临床报道较少。本研究结果显示，化学发光法检测SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体的敏感性分别为90.52%和75.86%，与文献报道[6-7]有一定的差异，可能与不同试剂的检测原理不同有关。ELISA检测SARS-CoV-2 IgG和IgM抗体的敏感性分别为63.79%和58.62%。2种抗体联合检测时，化学发光法的敏感性为100%，ELISA为68.97%。这提示2种抗体联合检测可显著提高检测效能。

针对同一抗体的不同检测方法（间接法、捕获法等）会因检测原理的不同而导致敏感性、特异性出现差异，本研究使用的化学发光法试剂盒的检测原理是基于直接化学发光技术的两步间接免疫法，针对的是SARS-CoV-2的核衣壳蛋白和刺突蛋白，采用免疫磁捕获技术对血清中的SARS-CoV-2抗体进行特异性捕获，由于磁性纳米颗粒具有大比表面积、较好的分离富集能力、易于操控等特点，能够快速富集、分离血清中的抗体，因而敏感性较高。本研究使用的ELISA试剂盒敏感性相对较低和出现假阴性的原因可能与重组抗原的制备、包被及酶标记重组抗原影响了抗原与抗体的结合力有关。目前，商品化的ELISA试剂往往需要借助酶的催化放大作用，通过结合在免疫复合物上的酶催化底物水解，使底物颜色发生改变来实现信号的输出，如果能够提高酶的催化水解效果，则可大大提高ELISA的检测灵敏度[8]。

目前，随着我国疫情形势的好转，SARSCoV-2无症状感染者受到越来越多的关注。由于无症状感染者无任何明显的症状与体征，在人群中难以被发现，其导致的疫情传播也难以预防。为此，要做好无症状感染者的监测，必须有针对性地加大筛查力度。实时荧光定量聚合酶链反应操作繁琐，检测耗时较长，对人员及实验场地等的要求较高，因此基层医院难以开展。本研究结果显示，化学发光法检测SARS-CoV-2 IgG抗体和IgM抗体的准确性分别为96.75%和96.86%，ELISA分别为88.31%和87.66%。虽然ELISA的准确性低于化学发光法，但2种方法的特异性均较高，化学发光法与ELISA检测IgG抗体的特异性分别为98.84%和96.53%，检测IgM抗体的特异性分别为99.42%和97.40%。2种方法的特异性差异无统计学意义（P＞0.05）。这表明采用化学发光法与ELISA检测血清SARS-CoV-2抗体可实现SARS-CoV-2感染的快速筛查与鉴别，尤其是在大规模复工复产人群的筛查中，ELISA成本低，可手工操作，不受仪器、场地限制，可作为SARS-CoV-2感染的筛查方法。

本研究结果还显示，在非COVID-19组中，化学发光法检出4例IgG抗体阳性、2例IgM抗体阳性。查看患者血清样本性状，有2例脂血严重、1例溶血，还有1例原因未明，可能与患者自身或试剂等因素有关；ELISA检出2例IgM抗体与IgG抗体联合检测阳性，此2例患者1例78岁、1例73岁，均患有自身免疫性疾病，类风湿因子均有不同程度的升高，因而造成检测结果的假阳性。另外，ELISA检测结果中还有6例弱阳性（A值稍高于Cut-off值），隔天重新采样复查后，结果均为阴性。

综上所述，化学发光法和ELISA检测血清SARS-CoV-2 IgG抗体和IgM抗体的敏感性、特异性、准确性均较高，可作为COVID-19的辅助诊断方法。另外，化学发光法适用于疑似患者的辅助诊断，而ELISA更适用于大规模人群的筛查，临床实验室可根据实际情况选择合适的方法。