流感病毒研究现状与进展

马 洲， 关 明， 邢志芳， 曹国君

（1.复旦大学附属华山医院北院检验科，上海 201907；2. 复旦大学附属华山医院检验医学科，上海 200040）

流行性感冒是由流感病毒引发的急性呼吸道传染病，春、秋季节高发，亚太地区高发[1]。

1 流感病毒病原学

流感病毒是直径为80～120 nm的球形或丝状的单股负链分节段RNA病毒，属正黏病毒科，其基因组包括8个独立的RNA片段[2]，第1、2、3 片段分别编码PB1、PB2、PA，参与病毒遗传物质的复制和转录；第4片段编码血凝素（hemagglutinin，HA），介导受体结合和膜融合，是流感病毒的主要免疫原性蛋白；第5片段编码核蛋白（nucleoprotein，NP），NP与病毒组RNA及PB1、PB2、PA相连构成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP），参与病毒的装配和RNA的合成；第6片段编码神经氨酸酶（neuraminidase，NA），NA可以清除细胞表面的唾液酸，防止病毒粒子聚集，促进病毒的释放；第7片段编码基质蛋白（matrix protein，MP），MP中的M1能维持病毒的形态，是病毒的主要结构蛋白，其与NP是病毒分型的依据；第8片段编码非结构蛋白NS1和NEP/NS2，NS1能拮抗宿主的非特异性免疫，并抑制干扰素产生，NEP/NS2可促进病毒RNA的表达，并参与其转运过程。

根据NP和MP的抗原性差异，流感病毒可以分为甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒及丁型流感病毒4类。（1）甲型流感病毒。该病毒宿主众多、血清型复杂，能够通过基因重组和适应性突变获得跨宿主传播能力。人类对甲型流感病毒缺乏持久的免疫力，所以所有年龄段人群均普遍易感，甲型流感病毒是引起流行性感冒大流行的最主要病原体[3]。甲型流感病毒表面蛋白HA有16个亚型，NA有9个亚型，病毒可根据HA和NA的组合情况进一步分类为若干亚型。由于HA和NA抗原结构能通过基因位点的突变或基因重组使病毒变异，因此甲型流感病毒属中的禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）能够突破种属屏障感染人类，目前能够感染人类的AIV有：H5N1、H5N6、H6N1、H7N7、H7N9等亚型[4]。AIV曾暴发式大流行，涉及多个国家和地区，如2009年暴发的甲型H1N1流感病毒[4]。（2）乙型流感病毒。该病毒多在小范围内流行传播，目前无亚型之分，引起人类感染的主要是乙型Yamagata系或乙型Victoria系。亚太地区的15个国家在每个月的流行性感冒确诊病例中，乙型流感病毒的确诊率为0～92%[1]，与甲型流感病毒不同，儿童、老年人等特定人群易感乙型流感病毒，并易引发并发症，对社会造成的负担甚至超过甲型流感病毒[5]。（3）丙型流感病毒。该病毒检出率较低，通常导致轻度感染，对公共卫生和健康影响较小。（4）丁型流感病毒。该病毒是最近几年才被发现的，主要感染牛、羊、猪等[6]。

2 流行性感冒的临床表现与病毒的传播途径

流行性感冒的临床表现主要为：咳嗽、鼻塞、头痛、咽喉痛、食欲减退、胸骨后不适、肌肉酸痛等全身性不适。甲型流感病毒感染患者常伴有发热，体温可达39 ℃，甚至超过39 ℃。感染乙型流感病毒的儿童多表现为呕吐、腹痛、腹泻。无并发症的流感病毒感染患者多为自限性病程，发病1周左右高热逐渐消退，全身症状好转。在儿童、孕妇、老年人和免疫缺陷群体等高危人群中，流感病毒可诱发严重的病毒性肺炎，导致多器官衰竭或基础疾病恶化。因儿童呼吸道保护屏障发育不完善，更易引起咽喉炎、支气管炎或肺炎等症状，有26.5%的季节性流行性感冒住院患儿可并发肺炎[7]。老年人由于常伴有呼吸系统、心血管系统等原发疾病，感染病毒后病情较重且进展快，肺炎发生率高于青壮年人群，且易诱发心力衰竭、急性心肌梗死或并发脑炎等疾病，在65岁以上老年人群中，流行性感冒相关死亡率与年龄呈正相关[8]。女性在怀孕期间呼吸系统功能明显改变，且免疫系统会介导细胞免疫向体液免疫转移，因此孕妇对于流感病毒的抵抗力更弱，感染后易发生肺炎、呼吸困难，甚至有流产、早产、胎死宫内等风险[9]。

被流感病毒感染后，患者的呼吸道分泌物中存在大量的流感病毒颗粒，可在打喷嚏和咳嗽时通过飞沫传播。此外，流感病毒也可通过口腔、鼻腔、眼睛等黏膜直接或间接接触传播[10]。对人类造成严重影响的AIV的传播方式主要是通过接触被感染禽类及其排泄物等，尚未发现人传人的现象[11]。由于病毒结合受体存在差异，甲型流感病毒通过人类呼吸道中的SAα2-6唾液酸受体感染宿主，而AIV感染禽类则是通过结合禽类胃肠道上的SAα2-3唾液酸受体[12]，因此AIV是否能实现宿主间的传播，关键在于其受体结合能力。

3 流感病毒的致病机制

流感病毒表面的HA和NA均有助于流感病毒的传播、增殖，且极易发生基因重组，增强病毒的致病性。HA能够识别宿主细胞表面的SA受体并与其结合，通过胞吞作用进入细胞内，促进M2离子通道的形成，而M2可促进病毒粒子进入宿主细胞核进行复制。同时，NA有助于新形成的病毒颗粒被释放，病毒即是以这种方式在细胞间传播。HA还含有对B淋巴细胞产生中和抗体起关键作用的抗原决定簇，因此HA的表位是影响病毒突变和重组机制的主要决定因素，其高变异性使病毒能够逃避宿主的免疫监视[13]。HA能够迅速活化蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），有利于病毒的侵入复制，并通过PKC—Ot的活化和核蛋白输出进一步激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路，使核输出更为有效，进一步促进病毒的复制。除此之外，非结构蛋白NS1和NEP/NS2的存在为病毒在宿主体内复制定植创造了基础条件，其中NS1能对抗宿主天然免疫反应，抑制干扰素产生；NEP/NS2则参与拮抗宿主抗病毒反应。

在免疫应答初期，细胞因子会帮助宿主抵抗病毒感染，但长期的持续感染会导致相关信号通路被激活，引起多种炎症因子级联放大，形成细胞因子风暴，从而导致急性肺损伤[14]。病毒的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR），包括Toll样受体（Toll like receptor，TLR）、RIG-I样受体（RIG-I like receptor，RLR）和NOD样受体（NOD like receptor，NLR）等，是抑制重症感染诱发免疫性病理损伤及研究非特异性免疫应答的重要靶点，流感病毒通过操纵这些信号分子可以有效使被感染宿主致病。TLR是病原体的主要传感器，TLR3介导病毒dsRNA的识别，TLR4介导急性肺损伤，高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）识别TLR4后活化核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）产生干扰素（interferon，IFN），可导致重症肺炎[15]。TLR7/8介导病毒ssRNA的识别，激活NF-κB，促进多种炎性细胞因子的分泌[16]。NLR能诱导产生多种细胞因子，但过度活化会导致免疫损伤，如NLRP3过度活化可导致非致命性流感病毒感染中的严重肺损伤[17]。除此之外，流感病毒能够激活p53，抑制干扰素诱导的跨膜蛋白，维持病毒的传染性，并可促进病毒繁殖[18]。

4 流感病毒的检测方法

目前，临床实验室检测流感病毒的方法主要为病毒分离培养、病毒抗原检测、病毒核酸检测等。

4.1 病毒分离培养

分离培养是最传统的病毒检测方法。将患者样本接种于细胞或胚胎中，繁殖7～10 d，监测细胞是否发生病变，然后通过特异性染色或免疫荧光显微镜等最终确认是否存在流感病毒[19]。离心细胞培养法（shell viral culture，SVC）是另一种病毒培养方法，与传统的病毒分离方法相比更简单、快捷、灵敏，可在24～48 h检测到病毒[20]，特异性高，是病毒感染诊断的金标准，也是疫苗研制的基础，但培养病毒耗时长、易发生支原体污染，难以满足大量样本或大量病原体快速检测的需求。

4.2 抗原检测

常用的抗原检测方法有直接免疫荧光法（direct immuno fluorescence，DFA）和流感病毒快速诊断测试（rapid diagnosis test of influenza，RIDT）。DFA是通过荧光直接标记流感病毒的特异性抗体，在荧光显微镜下观察鼻咽拭子的呼吸道上皮细胞中有无特异性病毒抗原；RIDT是采用免疫层析法，用胶体金或乳胶颗粒标记流感病毒抗体，通过抗原抗体特异性结合反应，30 min即可判读结果[21]。抗原检测的优点是操作方便、检测周期短、效率高，能满足短时间内检测大量样本的需求；缺点是检测敏感性和特异性不够高，只能区分甲型和乙型流感病毒，无法区分病毒的亚型，且抗原抗体易发生非特异性结合。

4.3 核酸检测

4.3.1 聚合酶链反应 聚合酶链反应技术的快速发展让传染病诊断有了更广阔的空间，相比抗原检测，核酸检测更为敏感，能够在早期检出临床样本中的病毒。目前用于人类流感病毒感染的检测方法有：逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）、逆转录环介导等温扩增技术（reverse transcription loop mediated isothermal amplification，RT-LAMP）、基于简单扩增的检测（detection based on simple amplification，SAMBA）、依赖核酸序列的扩增（amplification of DNA dependent sequences，NASBA）和微阵列技术等[20]。其优点是检测敏感性和特异性好，能够精确鉴别未知流感病毒株的分型，适用于筛选和鉴定亚型流感病毒。缺点是仅限于对单一病原体型别进行诊断，检测时间较长、操作复杂，对实验室和操作人员要求较高，且结果易受基因突变、抑制剂和RNA降解影响。

4.3.2 基因测序法 测序是基因诊断的金标准，通过测序技术可以准确、快速地获取生物体的遗传信息。ZHAO等[22]利用RT-PCR——下一代测序（next generation sequencing，NGS）诊断平台对161份临床样本进行检测，结果表明该平台能够在核酸低浓度条件下实现与实时RT-PCR相同的高灵敏度，并且能够提供流感病毒基因组全谱，实现多重识别和功能意义的同步鉴定。SEONG等[19]采用NGS深度测序技术，检测了鼻咽拭子等临床样本，结果表明该方法能有效地应用于调查致病性流行性感冒的分子特征。LEE等[23]在MiSeq测序器上开发了一种检测试剂盒和软件，对148份H3N2甲型流感病毒样本进行测序，结果表明该方法能有效控制高通量测序的样本污染率，并比Sanger测序更加高效。高通量测序法的优点是检测结果准确度高，可以对流感病毒进行准确的基因检测和分型，即使在发生基因突变的情况下也能实现，但检测成本较高、周期长，难以满足快速检测大量样本的需求，样本与样本之间存在交叉污染的可能，易造成假阳性。

4.4 其他检测方法

流感病毒的检测方法多种多样，芯片技术是其中之一。芯片技术起源于微机电系统，现已被用于多种病原体的检测。SHEN等[24]开发了一种以HA、NA阵列为特征的微流控芯片，通过使用聚糖包被的磁珠和RT-PCR，实现流感病毒的快速检测，并可在100 min内完成12种甲型流感病毒亚型的检测。LU等[25]建立了一个磁控数字化微流控平台，利用酶联免疫吸附试验检测甲型H1N1病毒抗体，整个分析过程可在40 min内完成，且灵敏度高，在快速诊断流感病毒方面具有很大的潜力。芯片技术反应效率高、检测通量高、试剂消耗少，但设备昂贵，操作比较复杂，只能检测已知的位点，容易出现假阳性结果。

5 流感病毒感染的治疗及预防

流感病毒表面的NA能促进成熟病毒颗粒脱落传播，而神经氨酸酶抑制剂（neuraminidase inhibitors，NAIS）可以与NA特异性结合，从而抑制病毒的传播、释放。奥司他韦能够将肠道中的酯酶转为活性代谢物，从而干扰病毒的传播，患者入院6 h内用药，有助于缩短住院时间、改善生存率[26]。但如果患者入院时已经出现了下呼吸道感染症状，即使使用奥司他韦，也无法更好地改善症状或降低病死率，但雷帕霉素和奥司他韦联合使用，对已发生严重免疫损伤的患者有一定疗效[27]，原因在于药物可通过抑制ALRP3介导的信号通路，进一步抑制病毒复制和免疫过度，缓解肺损伤严重程度，降低患者死亡率。帕拉米韦作为唯一的静脉注射类NAIS，疗效要优于其他NAIS，且对儿童和成人均有效，比口服奥司他韦能够更有效地缩短退烧时间[28]，但可能会与其他 NAIS相互耐药，且对奥司他韦耐药的患者疗效不理想[29]。有研究发现，咖啡酸与帕拉米韦联合使用能增加药物对NA的亲和力，是解决耐药性问题的突破口[30]。虽然长期使用帕拉米韦会诱导流感病毒位点的突变，削弱病毒复制能力，但会导致患者对所有的NAIS耐药，应谨慎使用[31]。

随着对NAIS耐药病例的日益增多，具有不同机制的新型抗病毒药物被研发出来，如巴洛沙韦。巴洛沙韦是一种帽依赖性核酸内切酶抑制剂，能够抑制病毒自身mRNA的转录[32]。有研究结果显示其不良反应发生率显著低于奥司他韦[33]。

每年全球范围内的流行性感冒病例中，有300万～500万例严重病例，与呼吸道疾病相关的死亡病例为29万～65万例[34]，接种疫苗仍是目前最有效的防范手段。现有的流感疫苗包括裂解疫苗、减毒活疫苗、全病毒灭活疫苗等。人用流感疫苗通常采用的是鸡胚法，但其操作复杂、生产周期长，目前科学家积极研发了犬肾细胞（Madin-Darby canine kidney，MDCK）、非洲绿猴肾细胞（african green monkey kidney cell，Vero）和人胚胎成视网膜细胞（human embryonic retinoblasts，PER.C6）等基于细胞培养的技术，用于流感疫苗的制备[35]。除了接种疫苗，在流行性感冒高发季节，建议采取佩戴口罩、勤洗手等防护措施，同时增强自身免疫力，注意保暖及空气的流通。如出现感冒症状，应注意休息，避免去人群密集场所造成病毒的二次传播，有发热现象应及时就医。

6 展望

流感病毒每年均反复引发人类呼吸道疾病，给社会经济和人类健康造成了沉重的负担[36]。目前预防和控制流行性感冒最为有效的措施就是接种疫苗。尽管公共卫生组织建议6月龄以上的人群都应接种流感疫苗，尤其是儿童、老年人、孕妇等易感人群及免疫功能缺陷的群体，然而由于流感疫苗的接种主要基于自愿、自费和我国人口基数庞大、流感疫苗需每年接种等原因，很大程度上影响了我国疫苗的接种覆盖率[37]。我们无法预测流行性感冒的发展趋势，是否会出现新的亚型、是否会跨物种传播、是否会造成新的大流行，所以仍需对流感病毒进行深入研究，积极研发更有效的疫苗和抗病毒药物，积极开发更有效的检测手段，尽量避免大流行的出现，确保公众健康。