罗汉果黄酮干预运动大鼠骨骼肌FLK-1及BFGF表达的影响❋

陈 功，莫伟彬，李国峰

(1. 广西经贸职业技术学院基础部, 南宁 530000； 2. 广西师范大学体育学院 广西 桂林 541004； 3. 药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室, 广西 桂林 541004)

运动能致使骨骼肌产生运动适应性变化，其主要表现为骨骼肌肉的机能改变、肌肉脂肪代谢能力的改善和不同骨骼肌肉组织形态学变化等。而毛细血管中密度的增加是骨骼肌肉的代谢基础，也是提高骨骼肌机能代谢的保障。而胎肝激酶1(fetal liver kinase，FLK-1)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibrolast growth factor，BFGF)是存在于肌纤维间质和毛细血管肌膜的一种特异性受体，是改善骨骼肌肉中毛细血管机能的重要因子。罗汉果为广西桂北地区著名的八大桂药之一，主要用于医药和饮料中，其果实中的甜苷、多糖、黄酮，块根中的淀粉及其药用成分等已有报道[1-2]。近年研究人员对罗汉果黄酮通过体外实验发现，罗汉果黄酮(momordica grosvenori flavones, MGF)具有抗氧化活性[3]、清除自由基[4]、抗疲劳和降糖及降血脂[5]等作用。前期的研究发现，服用罗汉果黄酮可提高力竭游泳大鼠股四头肌ATP酶的代谢和肌酸磷酸激酶的活性，并且通过光学显微镜对股四头肌组织切片的观察发现，罗汉果黄酮对保护股四头肌细胞膜具有良好的作用[6-7]。本研究通过建立力竭游泳训练大鼠模型，从能量代谢角度探讨罗汉果黄酮对大鼠骨骼肌FLK-1及BFGF在骨骼肌肉中毛细血管机能信号通路或调控作用，旨在为罗汉果黄酮在运动实践中的应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与药物

SPF级SD雄性大鼠50只，体质量(210.3±3.2)g,由桂林医学院动物实验中心提供(许可证SYXK(桂)2013-0001)。饲养期间室内温度(22±5)℃，湿度58%～70%之间，自由摄食和饮水。实验药物为葫芦科植物罗汉果果实的提取物，主要由黄酮、甜苷、槲皮素等多种化学活性成分组成，浅黄色粉末，味极甜，纯度>80%，熔点197～201 ℃(分解)，购于桂林兴达制药有限责任公司生产(批号20160603)。

1.2 仪器与试剂

PCR扩增仪(德国SENSO公司)；DYY-6C电泳仪(北京六一仪器厂)；K241R离心机(英国Centurion公司)；DHZ-032R恒温摇床(上海博彩科技公司)；化学发光成像系统(美国Carestream公司)；凝胶成像及分析系统(Bioserss-l805，上海山富科学仪器有限公司)。RT-PCR试剂盒(湖南晶科生物科技有限公司，批号20161019)；Trizol试剂盒(Sigma-aldrich，批号2016-52302)；考马斯亮蓝(Fluka 公司，批号T20130104)；FLK-1、BFGF及β-actin 抗体为鼠单抗(一抗体，武汉博士德，货号分别为A00901，C201710，BM0627)；羊抗鼠HRP-IgG(二抗体，南京生兴生物技术有限公司，货号SN134)；PVDF 膜(Millipore公司，NO：K5NA8022C)。BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号P0012S)。

1.3 动物分组及模型

大鼠适应性饲养1周，随机分为安静对照组(NC)、运动对照组(ME)、运动+低剂量罗汉果黄酮组(MGFL)、中剂量罗汉果黄酮组(MGFM)和高剂量罗汉果黄酮组(MGFH)。动物模型是按照前期实验动物模型[8]在120×70×60 cm玻璃箱进行游泳训练，水深45 cm，水温(28±2)℃。各训练组(ME、MGFL、MGFM和MGFH组)进行1周的无负重适应性训练后(20 min/d)，接着进行为期5周的力竭游泳训练，大鼠于每天上午8∶00进行负重游泳训练(大鼠每只尾部负自身体质量3%的铅坠进行游泳[9])，运动至力竭(90 min/d)，每日1次，每周6 d，对于短时间内力竭的大鼠，捞出休息5 min 后再进行游泳训练，使训练时间不少于90 min。力竭标准：大鼠头部沉入水下超过10 s仍不在返回水面；大鼠运动协调消失，在水中不定向乱窜，未达到10 s 亦定为力竭。

1.4 动物给药量与取材

各组大鼠分别在训练前30 min灌胃不同浓度的罗汉果黄酮溶液，罗汉果黄酮低、中、高剂量组剂量分别为100、200和400 mg·kg-1，灌胃体积为5.0 mL·kg-1，对照组灌胃等量生理盐水，连续给药 6周，每周6 d。训练结束后，于次日8时经20%乌拉坦溶液(3 mL/kg)麻醉，迅速取下腓肠肌，并置于-80 ℃冰箱中保存待测。

1.5 RT-PCR法检测FLK-1和BFGF mRNA表达

表1显示，取150 mg腓肠肌进行匀浆，根据Trizol试剂说明书提取总RNA，并测定总RNA浓度和纯度。然后取7.5 μL合成cDNA，其反应条件是(常温10 min，42 ℃/30 min，90 ℃/10 min， 4 ℃/10 min)。引物根据基因库同源基因序列进行设计，由上海生工合成。取cDNA产物 3.5 μL与FLK-1、BFGF与β-Actin合成引物进行PCR扩增反应，其反应条件为(95 ℃，30 s；94 ℃，30 s；退火(FLK-1, 56 ℃;BFGF, 55 ℃; β-Actin,40 ℃)30 s；72 ℃，1 min；35个循环)，72 ℃延伸5 min。最后，取15 μL PCR反应产物与上样液充分混合，点样于1.5%的琼脂糖凝胶板中电泳70 min。采用Bioserss-l805型凝胶成像系统进行成像分析FLK-1、BFGF和β-actin的光密度，其比值采用FLK-1、BFGF/β-actin表示。

1.6 Western Blot 法检测FLK-1和BFGF蛋白表达

取150 mg腓肠肌经剪碎后液氮研磨，裂解液充分裂解后，经离心(4 ℃，10000 r/min，20 min)，取上层清液于EP 管中，并采用BCA法进行蛋白浓度定量，以40 μg总蛋白上样，进行SDS-PAGE电泳，转膜(电流14 V, 100 mA，转印2 h)、封闭过夜后转入PVDF膜上。加FLK-1、BFGF抗体(均为1∶1000)、β-actin抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜。加羊抗鼠IgG-Biotin(1∶1000)孵育50 min，经PBST 洗膜后，加ECL化学发光底物于膜上，5 min后置于转移膜上进行曝光、显影、定影，采用凝胶成像系统对FLK-1或BFGF与β-actin蛋白条带的灰度扫描并用比值表示。

表1 引物序列与扩增长度

1.7 统计学方法

2 结果与分析

2.1 各组大鼠腓肠肌FLK-1和BFGF mRNA表达比较

表2显示，腓肠肌ME组FLK-1 mRNA表达高于NC组(P< 0.05)，腓肠肌MGFM和MGFH组FLK-1 mRNA表达显著高于ME组(P<0.01)。腓肠肌ME组BFGF mRNA表达显著高于NC组(P<0.01)，MGFH组BFGF mRNA表达显著高于ME组(P<0.01)。

表2 大鼠各检测指标表达比较

注：与安静对照组比较：aP< 0.05;bP< 0.01; 与运动对照组比较：cP< 0.05；dP<0.01

2.2 各组大鼠腓肠肌FLK-1和BFGF 蛋白表达比较

图1表2显示，腓肠肌ME组FLK-1蛋白表达显著高于NC组(P<0.01)，腓肠肌MGFH组FLK-1蛋白表达高于ME组 (P< 0.05)。腓肠肌ME组BFGF蛋白表达显著高于NC组(P<0.01)，MGFM和MGFH组BFGF蛋白表达均显著高于ME组(P<0.01)。

图1 各组大鼠FLK-1和BGGF蛋白表达比较

3 讨论

胎肝激酶1(FLK-1)和碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)是存在于肌纤维间质和毛细血管肌膜的一种特异性受体。FLK-1是血管内皮生长因子(VEGF)的不同受体之一，属于酪氨酸激酶受体家族的第Ⅲ亚型。FLK-1的表达广泛存在于机体组织的肝、肌肉、脑、心、肺和肾等组织中，具有介导骨骼肌内皮细胞存活，改善血管通透性(氧运输)，活化、血管的形成和改变细胞形态的生物效应等作用。BFGF是机体内的一种血管生成因子和多功能生长因子，具有保护血管内皮层、参与机体生长发育和组织损伤修复等生理作用。它的表达主要存在于机体内的心肌、骨骼肌、大脑、肝、肾和腺等多种组织中，其中骨骼肌中BFGF的蛋白表达主要存在于毛细血管肌膜和肌纤维间质里[10]。此外，BFGF还能诱导VEGF受体的表达，从而增强VEGF的作用。在运动中骨骼肌组织的缺氧上调VEGF的表达，从而促进FLK-1受体的结合，维持血管功能的完整性[11]。BFGF在运动中表达的增加促进VEGF的产生，参与骨骼肌组织中毛细血管新生的过程[12]。陈红英等[13]研究发现，FLK-1 mRNA表达上升能够防治和改善大鼠再灌注损伤血管内皮功能紊乱。刘秀娟[14]研究发现，力竭训练能上调大鼠腓肠肌BFGF mRNA表达，促进骨骼的损伤修复。徐瑾瑜[15]研究发现，通过补充丹龙醒脑方后能增强VEGF、FIL-1和BFGF的蛋白表达。曹丽[16]研究发现，通过7个月抗阻训练后的小鼠VEGF、FIL-1和BFGF mRNA表达明显增加，表明运动激活发展BFGF及FLK-1信号传导通路和骨骼肌的代谢能力。本研究发现，运动对照组大鼠腓肠肌FLK-1和BFGF mRNA及蛋白表达均高于安静对照组，提示运动可能促进骨骼肌血液的重新分配，增强骨骼肌的能量代谢和有氧工作能力。通过补充不同剂量的罗汉果黄酮后，低剂量组下调大鼠腓肠肌BFGF mRNA及蛋白表达，这可能是在运动中骨骼肌吸收并代谢罗汉果黄酮防止自由基的产生，保持能量动态平衡。但在高剂量组时大鼠腓肠肌FLK-1和BFGF mRNA及蛋白表达达到峰值，这些变化提示FLK-1和BFGF 表达量的升高与骨骼肌损伤、再生与修复可能存在着一定的关系，提示运动大鼠在罗汉果黄酮的干预下，有利于维持血管的完整性，增加肌肉组织供血能力和提高氧运输能力，从而防止运动中肌肉的损伤，但其机制还有待深入研究。总之本实验证明，运动中补充罗汉果黄酮能够增加机体内肌肉组织供血能力和提高氧运输能力，延缓运动疲劳的发生，同时为开发和应用罗汉果黄酮提供重要的科学依据。