针刺对8-MOP/UVA诱导光老化模型小鼠皮肤SOD、MDA、T-AOC、LF、ATP酶的影响

王彩霞

(宁夏医科大学中医学院，银川 750004)

皮肤光老化(Skin Photoaging)是指暴露部位皮肤长期受日光中紫外线照射所引起的皮肤外源性老化[1-2]，临床表现为皮肤松弛、干燥粗糙、皱纹加粗加深、色素沉着异常、血管扩张、表皮角化不良及出现皮革样外观等，严重者可引起癌前病变甚至导致皮肤恶性肿瘤[3]，因此预防和延缓皮肤光老化已成为医学研究的热点之一。中医针灸具有简便、易行、省时、省力、无毒副作用等特点，近年来针灸抗衰老已成为中医学研究的一个新领域。“足三里”和“关元”是防病抗衰的重要穴位，被称为“保健穴”和“长寿穴”，具有健运脾胃、强壮机体之功，为治疗诸虚百损的常用穴位。本研究利用1%甲氧沙林溶液(8-MOP)联合长波紫外线(UVA)照射小鼠皮肤，建立光老化小鼠模型，通过针刺模型小鼠“关元”穴和双侧“足三里”穴，检测其对皮肤组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)、ATP酶活性及和脂褐素(LF)水平的影响，探讨针刺抗衰老的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康清洁级2月龄昆明种小鼠40只，雌性各半，体质量(20～25)g，均购自宁夏医科大学实验动物中心。

1.2 药品与试剂

8-MOP，华邦制药股份有限公司；维生素E胶丸，大连天宇奥森制药有限公司。SOD试剂盒(批号20150525)，MDA试剂盒(批号20150308)，T-AOC试剂盒(批号20150503)，LF试剂盒(批号20150411)，ATP酶试剂盒(批号20150423)均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器

UVA灯管，紫外照射仪(Sigma公司)；UVA型紫外辐射计(北京师范大学光电仪器厂，波长范围315～400 nm，波峰365 nm)；DK-420S型三用恒温水箱(上海精宏实验设备有限公司)；722分光光度计(上海第三分析仪器厂)；DY89-Ⅱ电动玻璃匀浆机(上海将来实验设备有限公司)；TDL-5-A型离心机(上海安亭科学仪器厂)；MK3型酶标仪(Lab公司)；BLG10电子秤(上海精科天美科学仪器有限公司)。

1.4 方法

40只小鼠随机分为空白组、模型组、针刺组、阳性对照组(维生素E组)4组各10只。用电动理发器剃除小鼠背部体毛，使其背部皮肤充分暴露，面积约2×2 cm，脱毛后第2天开始实验。空白组将小鼠四肢捆绑固定在固定架上，每天涂抹1次双蒸水，无其他任何处理；模型组做相同捆绑固定，并根据文献[4]于小鼠背部皮肤暴露部位每天涂抹1% 8-MOP 1次，1～2 h后再给予190 v/w的UVA照射，累积照射时间138 h(累积强度为95 J/cm2)。照射过程中用纸扳遮挡小鼠头部，照射结束后24 h内取皮肤；针刺组捆绑固定后，按照光老化模型制备方法进行操作，取小鼠“关元”穴及双侧“足三里”穴，定位及取穴方法参照余曙光主编的《实验针灸学》[5]。采用32号0.5寸毫针在照射前30 min进行针刺，每穴持续捻转刺激30 s，以小鼠不挣扎嘶吼并保持安静为度,每次留针5 min，上述操作每天1次。阳性对照组(维生素E组)相同捆绑固定，采用维生素E胶丸涂抹造模部位。照射结束后24 h内取皮肤组织。

1.5 指标测定

治疗结束后24内脱椎处死小鼠，立即取颈背部皮肤组织0.5 g左右，经预冷生理盐水漂洗后除去多余脂肪和其他结缔组织，制成10%的皮肤组织匀浆，测定其SOD、T-AOC、ATP酶活性和MDA、LF含量,严格按照试剂盒提供的方法测定。

1.6 统计学方法

2 结果

表1显示，与空白组比较，模型组小鼠皮肤组织SOD、T-AOC及ATP酶活性均降低(P<0.01)，MDA、LF含量均升高(P<0.01)。与模型组比较，针刺组、维生素E组小鼠皮肤组织SOD活性均显著增强(P<0.01)，T-AOC活性明显增强(P<0.01，P<0.05)，ATP酶活性明显增强(P<0.01，P<0.05)， MDA含量显著降低(P<0.01)，LF含量显著降低(P<0.01)。

表1 各组皮肤组织中SOD、T-AOC、ATP酶活性及MDA、LF含量比较

注：与空白组比较：▲▲P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

皮肤衰老是一个复杂、多因素综合作用的过程，包括内源性衰老和外源性衰老[6]。内源性衰老是指随着年龄的增长皮肤出现自然老化的过程，外源性衰老主要指皮肤光老化，而紫外线是引起皮肤光老化最主要的影响因素[7]。紫外线在自然界由太阳辐射产生，按其波长可分为长波紫外线(UVA，315～400 nm)、中波紫外线(UVB，280～315 nm)和短波紫外线(UVC，100～280 nm)，其中UVC经过大气层时被臭氧层吸收，对机体产生作用的主要是UVA和UVB[8]。而UVA穿透力极强，是UVB 的500～1000倍，可到达皮肤基底层与真皮层，是皮肤晒黑的主要原因[7]。本实验采用8-MOPUVA联合制备光老化小鼠模型，相比传统常用的UVA联合UVB或单纯使用高剂量UVA照射大大缩短了造模时间，且皮肤照射损害相对较小，而皱纹却明显增加[9]。

目前认为，紫外线照射皮肤后可以产生高度反应的自由基，过量的自由基可攻击细胞膜等生物大分子产生过氧化反应，形成多种脂质过氧化物及其代谢产物[10]。SOD是机体清除自由基的主要抗氧化酶，能减少氧自由基和过氧化脂质的生成，其活性的高低可直接反映机体清除自由基的能力；MDA是生物体内过氧化脂质的代谢产物，其含量的高低可反映组织细胞受自由基损伤的程度。生物体内MDA进一步侵害细胞生成LF，LF是具有光毒性的细胞内沉积物，它可在细胞生长衰老过程中逐渐积累，并造成细胞功能障碍，如沉积在动物皮肤细胞中，可使皮肤粗糙、黯淡、无光泽并产生皱纹、色斑等[11]。T-AOC可反映皮肤中酶与非酶的全部抗氧化物，是一个全面反映皮肤组织抗氧化能力的良好指标。ATP酶是一种蛋白酶，存在于组织细胞及细胞器膜上，它在物质运送能量转换以及信息传递方面具有重要作用，是体现机体抗氧化能力的重要活性酶之一[12]。由此可见，上述指标(SOD、MDA、T-AOC、LF、ATP酶)是直接关切生物体内“氧化”损害与“抗氧化”的相关指标，而它们则有可能是引起或延缓皮肤衰老的关键因素。

中医学认为，皮肤光老化的发病主要是由于五脏虚损、气血不足、肌肤失养，或痰浊瘀阻腠理，复感光毒所致[13]。因此，正虚邪实是皮肤光老化的主要病机。针灸抗衰老的作用机制在于扶正固本、调节气血的生成和运行，使气充血旺，运行有度[14]。“足三里”穴是足阳明胃经的合穴，为回阳九针穴之一，具有补中益气、健运脾阳、培土化元、强壮保健之功，属后天之本，为健脾补虚培元之要穴[15]。“关元”穴为任脉穴位，是任脉与足三阴经的交会穴，具有培本固肾、调理冲任、补益精血之功，属先天之本，是古今强壮保健的要穴，为历代医家所推崇。“关元”与“足三里”两穴配合，既能充养先天又能培补后天，使先后天之本有机结合，使“正气存内，邪不可干”，从而达到固护正气、防病抗衰的目的[16]。