杜仲无糖组培生根微环境控制技术①

王 立 黄宏健 李小燕 谭沛涛 胡 杨 叶 棠 梁慧霞 陈小玲

（1 江门市新会区林业科学研究所 广东江门 529100；2 广东南方职业学院 广东江门 529100）

杜仲（Eucommia ulmoidesOliv）为杜仲科杜仲属落叶乔木，为我国特有的多用途珍贵树种，树皮为传统中药材，可治疗肾虚腰痛、足膝酸痛、关节炎等［1-3］，杜仲胶还是重要的工业原料。因此，杜仲是难得的集多功能、多用途为一体的特色树种，在用材林，中药材，生态保护，绿化美化等方面均具有广阔的应用前景。目前，杜仲生产以种子繁殖为主，但种子发芽率低，种子苗个体间杜仲胶含量及药用有效成分参差不齐［4-5］，加之杜仲苗不容易生根，在常规培养基生根培养容易使培养基褐化［6-7］。因此，从1994 年开始，陆续有关于杜仲组培快繁研究的报道，如以杜仲种子实生苗为材料进行诱导获得完整植株［8-13］。由于杜仲外植体消毒难，污染率高，为达到无菌效果，需在培养基中添加抗生素以控制污染［14-19］，加上壮苗培养不理想，生根后成活率低，限制了生产效率，难以达到工厂化生产需求［20-23］。因此，通过建立杜仲无糖组培微环境，提高生根率，节省壮苗时间，为探寻杜仲快速繁殖、规模化生产提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

采用江门市特色植物种苗工程中心选优培养的杜仲组培继代苗，通过分化形成叶片且长势一致的杜仲瓶苗。

1.2 方法

杜仲瓶苗每段带2片叶，接种到无糖组培容器后，转移到无糖组培培养室进行培养。培养液为不添加植物激素的改良无糖组培液体培养基。采用传统组培方法，以添加30 g/L 蔗糖的MS 空白培养基为CK1，以添加30g/L 蔗糖的0.5 MS+0.05 NAA+0.02 IBA 培养基为CK 作对照，培养室光照强度为5 000 lx，培养室湿度控制在70%～80%。设置7 个不同水平的CO2浓度：800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800、2 000 μmol/mol，通气时间为每天9：00～18：00，CK 通入空气，筛选出最佳CO2浓度。设置7 个不同水平最高通气量：600、800、1 000、1 200，1 400、1 600、1 800 mL/min，CK 为透气膜培养，不强制换气。每个处理50株苗，重复2次。

1.3 统计分析

试验数据采用Excel 2012 进行整理，采用SPSS 22.0软件进行差异显著性检验（LSD法）。

2 结果与分析

2.1 不同CO2浓度对杜仲组培苗生长的影响

2.1.1 方差分析

由表1 可知，不同CO2浓度下，杜仲组培苗株高、茎粗、根数、最长主根根长和干重指标均存在极显著差异（p＜0.001），相同浓度的2 次重复之间差异不显著。

2.1.2 多重比较

不同CO2浓度对生根情况影响存在较大差异（表2），通入CO2处理组的出根时间、最长根长、根数及生根率均显著优于对照组CK，说明在杜仲无糖组培中，通入CO2对杜仲苗生根具有一定的促进作用。当CO2浓度为1 400、1 600 μmol/mol 时，杜仲组培苗生根率和生长状态较好，出根时间分别是31、30 d；最长主根根长分别是6.26、6.20 cm；平均达到 3.53、3.10 条；生根率均为100%（表2）。

由表3 可知，通入不同浓度CO2的处理组生长情况均明显优于对照组，其中以CO2浓度为1 400、1 600 μmol/mol 的生长情况最优，径粗分别为1.81、1.76 cm，株高分别为7.43、7.38 cm，干重分别为123.39、126.74 mg。

表2 不同CO2浓度对杜仲组培苗生根的影响

表3 不同CO2浓度对杜仲组培苗生长的影响

2.2 不同CO2通气量对杜仲组培苗生长的影响

2.2.1 多重比较

设定培养室通入的CO2浓度为1 400～1 600 μ mol/mol，测量组培苗的生长状况，筛选出最合适的换气量。

不同CO2最大通气量对杜仲组培苗根部及地上部分生长影响不同，与对照组相比，强制换气的处理组生长情况更佳且差异显著，其中通气量为1 400 mL/min 时生长情况最佳，株高为7.35 cm，平均叶片面积为2.94 cm2，最长主根根长为6.25 cm，根数为4.07 条；其次为通气量1 600 mL/min，株高为7.35 cm，平均叶片面积为2.62 cm2，最长主根根长为5.02 cm，根数为3.07 条（表4）。

表4 不同CO2最大通气量对杜仲组培苗生长的影响

2.2.2 相关性分析

杜仲组培苗通过光合作用吸收CO2作为碳源。在一定范围内，随着CO2浓度及通气量的增加，株高、叶片面积会随之增加，说明组培苗可以适应较高的CO2浓度，由于根部主要靠吸收氧气和水分进行生命活动。因此，高浓度的CO2不一定适合杜仲组培苗根部的生长。

由表5 可知，不同CO2通气量，株高与叶面面积呈正相关关系，株高与最长根长间存在一定相关性，叶片面积和最长根长间存在弱相关，根数与株高和叶片面之间的相关性最弱。

表5 杜仲组培苗个生长指标的相关性分析

3 讨论

杜仲无糖组培苗实验可以发现，通入CO2并进行强制换气的组培苗木生长情况要明显优于不通入CO2或者不进行强制换气的苗木。在光期，C3植物通过光合作用，固定CO2中的碳元素合成自身营养物质。因此，通入CO2时间应与光照同步，夜晚可停止CO2供应。加大环境中CO2的浓度有利于植株的光合作用，而通过增加容器换气量，有利于维持CO2浓度相对稳定。杜仲组培苗在有强制性换气条件下比自然换气的条件下生长要好。

输入CO2会引起培养容器中湿度和气体浓度变化，这种微环境变化会影响到杜仲组培苗的生长发育。因此，通气量在无糖组培微环境调节中有着关键的作用。在接苗初期，应当严格控制通气量以保证容器湿度，缓解由于蒸腾作用带走的水分。接苗后一周，使容器湿度维持在95%以上，接苗一周之后开始逐渐降低容器湿度，这时比较有效的方法就是强制换气，即通入CO2300～400 mL/min，湿度维持在80%。第二周加大通气量，通气量为800～1 000 mL/min，湿度维持在70%左右。第三周湿度维持在60%，通气量控制在1 200～1 400 mL/min，最后通气量保持在1 400～1 500 mL/min，这时杜仲苗生长最快，状态最好，对外界环境的适应能力最强，栽植成活率最高。在无糖组培整个生长阶段，温度始终保持在25oC 左右，当通气量达到最大值后，培养室温度可以适当调高2～3oC，以便让植物更好的适应外界环境。