大豆益生元发酵豆乳的制备及其对益生菌数量的影响

雷海容，张枫燃，梁洪祥，李晓东

（1.长春大学科技开发研究中心，吉林长春130022；2.延边大学，吉林延吉133002）

益生元是指不被人体消化吸收却可以选择性促进肠道中益生菌的生长和繁殖，从而改善人体健康的物质[1]。大豆低聚糖（soybean oligosaccharides，SBOS）国家标准[2]中包括蔗糖，但蔗糖并无低聚糖所具有的功效。功能性SBOS 是3 糖构成的棉子糖与4 糖构成的水苏糖聚合同系物，不被胃酸分解，也不被人体吸收代谢，属于益生元范畴[3]。功能性SBOS 具有阻止致病菌的定居和繁殖，调节人体肠道菌群平衡；防治腹泻与便秘的双向调节功能[4]；降低血压、防治肝病[5]、增强免疫功能[6]；预防肿瘤并使部分胃癌细胞凋亡[7]等多种保健作用。

益生菌是指对人体健康有益且与人共生的细菌或微生物。干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌同为益生菌，同属于乳杆菌属。两菌株的益生保健功能除均可增强机体免疫系统[8-9]外，干酪乳杆菌具有降血压、降胆固醇[10]的功效；鼠李糖乳杆菌具有改善宿主肠道健康等功效[11]。

豆乳经益生菌的发酵作用不仅变得美味，还可分解大豆中的抗营养因子，营养成分更趋完善[12]，更易于人体的消化吸收。本研究是以超微粉碎后的脱皮大豆与脱脂牛乳为主要原料，利用功能性SBOS 发酵稳定性的生物学特性，采用干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌混种发酵提纯功能性SBOS，制作具有促进增殖肠道益生菌、提高肠道功能、维持肠道健康的保健型发酵豆乳。大豆益生元发酵豆乳除上述保健功效外，还含有脱皮后大豆子叶全部的大豆蛋白质及大豆膳食纤维，制作过程中不除渣、不产生废水，对环境无污染，具有广阔的市场应用发展前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SBOS（水苏糖与棉子糖占30%、蔗糖占40%）：长春大学科技开发研究中心；果胶：上海颖心实验室设备有限公司；蔗糖：南京甘汁园糖业有限公司；干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌：由吉林农业大学兽医药理与毒理学实验室储藏并提供，两种菌以1 ∶1 的比例添加；蔗糖标准品、水苏糖标准品、棉子糖标准品、乙腈（色谱纯）：美国Sigma 公司；乳酸细菌培养基（lactic acidbacteria culture，MRS）固体及液体培养基：青岛海博生物技术有限公司；脱皮大豆、脱脂牛乳粉：市售；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器

FW100 高速多功能粉碎机：浙江省永康市象珠松青五金厂；QYF-100 实验室用气流粉碎机：昆山密友实业有限公司；APV-1000 型实验型高压均质机：上海顺仪实验设备有限公司；LC-20A 型高效液相色谱仪、RID-10A 型示差折光检测器：日本岛津公司；CSB-SY型超声波振荡器：金坛市华城润华实验仪器厂；ME204E 型药物分析天平：METTLER TOLEDO 仪器公司；FA2204B 型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；Mini-15K 微型高速离心机：杭州奥盛仪器有限公司；HZQ-F160（A）C 型高低温恒温振荡培养箱：常州诺基仪器有限公司；SPX 型智能生化培养箱：宁波市江南仪器厂；SJ-CJ-1FDQ 型超净工作台：苏州苏洁净化设备有限公司；DSX-18L 手提式高压蒸汽灭菌器：上海申安医疗机械厂；AG25 厌氧培养罐（2.5 L）：临沂正衡化玻仪器有限公司；WP-UP-1820 型实验室超纯水机：四川沃特尔水处理设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 配制脱脂乳培养基

将12 g 脱脂牛乳粉加100 mL 纯水制成质量浓度12 g/100 mL 的脱脂乳液，盛入三角瓶中，封口后置于灭菌锅中在115 ℃条件下蒸汽灭菌15 min，迅速冷却后冷藏备用。

1.3.2 菌株的活化

将干酪乳杆菌及鼠李糖乳杆菌斜面试管从冰箱中取出，置于20 ℃下约15 min，开启超净工作台待用，在无菌条件下挑取菌种于脱脂乳培养基中37 ℃培养24 h，活化培养3 代，获得活力较好的菌种。

1.3.3 发酵剂的制备

将冰箱中保存的干酪乳杆菌及鼠李糖乳杆菌斜面试管取出，置于20 ℃下约15 min，在无菌条件下挑取少许菌株接种于MRS 固体培养基上，置于厌氧罐中37 ℃厌氧培养至菌落清晰可见，进一步挑取单菌落于MRS 液体培养基中，菌液保存待用。

1.3.4 检测大豆益生元发酵豆乳发酵期间蔗糖质量

分别称取5.0 mL 及2.0 mL 样品于100 mL 容量瓶中，编号后分别加乙酸锌溶液与亚铁氰化钾溶液各5 mL，加水定容至刻度，经超声波振荡器振荡30 min后离心，再经0.45 μm 孔径的微孔滤膜过滤，所得滤液用于高效液相色谱分析。采用高效液相色谱系统分离后，经示差折光检测器检测进样液浓度。在一定条件下制作标准曲线，通过与标准曲线比较，计算得出大豆益生元发酵豆乳发酵期间的蔗糖质量[13]。

1.3.5 检测大豆益生元发酵豆乳发酵期间水苏糖与棉子糖质量

称取 2.0 mL 样品，定容至 100 mL，混匀，经 0.45 μm孔径的微孔滤膜过滤，所得滤液用于高效液相色谱分析。采用高效液相色谱系统分离后，经示差折光检测器检测进样液浓度。在一定条件下制作标准曲线，通过与标准曲线比较，计算得出大豆益生元发酵豆乳发酵期间的水苏糖与棉子糖质量[14]。

1.3.6 益生菌数量的检测

选择正常对照组、阳性对照组、不同体积的大豆益生元发酵豆乳，共5 组发酵豆乳检测其益生菌的数量。按制备方法制备发酵豆乳，采用蔗糖接种发酵豆乳作为正常对照组；采用山东产大豆低聚糖冲剂接种发酵豆乳作为阳性对照组，将正常对照组、阳性对照组与大豆益生元发酵豆乳加入MRS 液体培养基中培养48 h，将样液进行梯度稀释，分别选择10-8～10-13的梯度稀释样液各0.1 mL 涂布于平板上，37 ℃厌氧培养72 h[15]，检测各组分发酵豆乳中益生菌数量。每个试验进行3 次平行试验，结果取平均值，以CFU/mL 报告测定值。

1.3.7 大豆益生元发酵豆乳的制备方法

1.3.7.1 工艺流程

1.3.7.2 操作要点

1）粉碎

脱皮大豆经多功能粉碎机粗磨后98 %过80 目筛，送入频率150 Hz 气流粉碎机内处理，得到直径约为50 μm[16]的超细粉末过200 目筛。超微粉碎可使大豆膳食纤维结合水力提高1 倍[17]，品质得以改善。

2）高温煮沸

将过筛后的大豆全子叶豆粉按适当的质量体积比加纯水高温煮沸10 min[18]，期间不断搅拌，使其分散均匀。高温煮沸可使膳食纤维颗粒细化，提高水溶性膳食纤维转化率，降低口感粗糙程度，使苦味与豆腥味消失，增加大豆香味，更重要的是可使大豆中对人体有害的多种抗营养因子钝化失活，以实现预熟化目的。

3）调和、均质与杀菌

果胶需要全部溶解后，再与脱脂乳粉及冷却后的豆乳调和后送入均质机中均质2 次，经90 ℃条件下杀菌10 min[19]制成发酵豆乳培养基。均质条件为温度45 ℃、压强30 MPa、时间120 s[20]。均质可使豆乳中脂肪与蛋白质粒径减小，防止脂肪上浮，达到蛋白质与糖的结合，同时也将少量变性蛋白质颗粒进一步细化，并且延缓或防止凝乳形成后乳清大量析出，提高稳定性，获得良好的质感，可使发酵后的豆乳组织细腻、口感柔和，更易于人体的消化吸收。

4）接种与发酵

将干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌按1 ∶1 比例接种于冷却后的发酵豆乳培养基，同时加入杀菌后的SBOS 进行发酵。益生元发酵豆乳采用干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌可利用蔗糖发酵[21]的生物学特性，以达到提纯功能性SBOS 的目的。由于大豆水苏糖与棉子糖在高温、高压条件下不发生分解现象，因此SBOS 的杀菌条件设定为121℃，压强30 MPa 处理15 min。发酵期间随时检测蔗糖、水苏糖及棉子糖的质量。发酵豆乳中各组分糖质量与发酵初始时相比：水苏糖与棉子糖保留率达到86%以上，蔗糖消耗率达到90%以上时，即标志发酵完成。

5）成品

将发酵完成的大豆益生元发酵豆乳放入4 ℃冰箱后熟18 h～24 h，制成成品大豆益生元发酵豆乳。采用MRS 琼脂平板菌落计数法[15]检测益生菌数量。

1.3.8 单因素试验及正交试验设计

由孟岳成[22]研究结果可知，果胶的添加量0.3 %时，发酵豆乳表面更光滑细腻，冷藏期间更稳定，因此果胶的添加量确定为0.3%。根据预试验结果，选择影响大豆益生元发酵豆乳感官品质的主要因素进行单因素试验及正交试验设计。根据益生元发酵豆乳的制备方法，采用单因素试验方案，分别研究豆粉与水的质量体积比、脱脂乳粉添加量、SBOS 添加量、接种量、发酵温度及发酵时间对大豆益生元发酵豆乳的感官品质的影响，找出每个因素的具体影响规律，并确定影响大豆益生元发酵豆乳品质的主要因素的最优水平变化范围。根据单因素试验结果，以大豆益生元发酵豆乳的感官评价为考察指标，按表1 进行六因素五水平的正交试验，筛选大豆益生元发酵豆乳的最佳工艺条件，并进行最佳工艺条件的验证试验。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.3.9 大豆益生元发酵豆乳的感官评价

以大豆益生元发酵豆乳的表观、气味、风味及质地[23]为评定指标。通过经培训过的10 位评价员，独立进行专家问卷打分，评定每个样品间用清水漱口，每人的各项指标得分相加为总分，满分为100 分，取每位评价员总分的平均分为感官评分值，最后统计得出综合评分。大豆益生元发酵豆乳的感官评价标准见表2。

表2 大豆益生元发酵豆乳的感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria of soybean prebiotic fermented soymilk

1.4 数据分析

数据处理方法应用SPSS 17.0 统计软件，测定指标均表示为3 次平行试验的平均值，差异显著性采用Student-t 检验处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 豆粉与水的质量体积比对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响

豆粉与水的质量体积比对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响见图1。

图1 豆粉与水的质量体积比对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响Fig.1 Effects of ratio of mass to volume of soybean and water on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

大豆通过气流粉碎机处理后，细胞的比表面积和孔隙率均增大[16]，益生元发酵豆乳的口感与功能性均可得到改善。由图1 可知，随着质量体积比的增加益生元发酵豆乳感官评分呈现先上升后下降的趋势。当质量体积比达到1 ∶12（g/mL）时，益生元发酵豆乳口感细腻，无粗糙的颗粒感，颜色呈乳白色，感官评分达到最高值。当质量体积比超过1 ∶12（g/mL）时，益生元发酵豆乳感官评分呈下降趋势，乳清析出影响了感官品质。因此，选择豆粉与水的最佳质量体积比为1 ∶12（g/mL）。

2.1.2 脱脂乳粉添加量对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响

脱脂乳粉添加量对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响见图2。

图2 脱脂乳粉添加量对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响Fig.2 Effects of skim milk powder addition on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

豆乳中添加牛乳可以促进豆乳发酵，同时去除让人不愉快的异味，改善益生元发酵豆乳风味，提高感官品质。由图2 可知，随着牛乳添加量的增加，益生元发酵豆乳的感官评分逐渐升高，当脱脂乳粉添加24%时，益生元发酵豆乳风味独特，感官评分最高；当脱脂乳粉添加量继续增加，感官评分逐渐下降，这是由于奶油味影响益生元发酵豆乳的感官品质。因此，选择脱脂乳粉最佳添加量为24%。

2.1.3 SBOS 添加量对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响

SBOS 添加量对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响见图3。

由图3 可知，随着SBOS 增加量的增加，益生元发酵豆乳感官评分先上升后下降，当SBOS 添加量为25%时益生元发酵豆乳的风味酸甜适中、凝乳坚实、表面及切面光滑细腻，感官品质最佳。当SBOS 添加量超过25%，益生元发酵豆乳酸化严重，影响其感官品质。因此，选择SBOS 最佳添加量为25%。

图3 SBOS 添加量对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响Fig.3 Effects of SBOS addition on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

2.1.4 发酵时间对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响

发酵时间对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响见图4。

图4 发酵时间对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响Fig.4 Effects of fermented time on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

由图4 可知，当发酵7.0 h 时益生元发酵豆乳的风味酸甜适中、凝乳坚实、表面及切面光滑细腻，感官品质最佳。当发酵时间超过7.0 h，益生元发酵豆乳酸化严重，影响其感官品质。

发酵期间各组分糖的变化见图5。

由图5 可知，发酵5.5 h 蔗糖的保留率为72.55%，随着发酵时间延长蔗糖保留率也在降低，当发酵7.0 h时蔗糖保留率低至9.42%，棉子糖与水苏糖的保留率分别为64.11%和94.01%，益生元的保留率为86.53%，蔗糖的消耗率为90.58%，此时结束发酵。由于发酵7.0 h 后蔗糖消耗速度逐渐缓慢，功能性SBOS 参与发酵，保留率也逐渐降低，无法达到提纯功能性SBOS 的目的。因此，最佳发酵时间确定为7.0 h。

2.1.5 接种量对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响

接种量对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响见图6。

图5 发酵期间各组分糖的变化Fig.5 The curves of the change of sugars of each component during the fermentation

图6 接种量对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响Fig.6 Effects of inoculum concentration on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

接种量的大小是影响益生元发酵豆乳感官品质的关键因素。接种量过低会延长发酵时间，益生元发酵豆乳产酸速度慢易受细菌污染；接种量过高发酵速度加快，益生元发酵豆乳过酸影响感官品质。由图6可知，接种量为1%～5%时，感官评分呈上升趋势，当接种量为5%时，感官评分达到最高，接种量为5%～11%时，感官评分逐渐下降。因此，选择最佳接种量为5%。

2.1.6 发酵温度对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响

发酵温度对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响见图7。

发酵温度是影响益生元发酵豆乳感官品质的重要因素之一。温度过低，干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌的增长速度变得缓慢，益生元发酵豆乳风味差，质地松软；温度过高，干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌的生理活性受到抑制，益生元发酵豆乳有豆腥味，发酵豆香味不足。由图7 可知，发酵温度为31 ℃～37 ℃时，感官评分逐渐上升，当发酵温度为37 ℃时，感官评分达到最高，发酵温度为37 ℃～41 ℃时，感官评分呈下降趋势。因此，选择最佳发酵温度为37 ℃。

图7 发酵温度对大豆益生元发酵豆乳感官品质的影响Fig.7 Effects of fermented time on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

2.2 正交试验

2.2.1 L25（56）正交试验结果、极差及方差分析

正交试验结果及极差分析见表3。

表3 正交试验结果及极差分析Table 3 The orthogonal experiment results and range analysis

续表3 正交试验结果及极差分析Continue table 3 The orthogonal experiment results and range analysis

由表3 可知，影响大豆益生元发酵豆乳感官品质的因素主次顺序为 RD＞RC＞RF＞RE＞RA＞RB，再以 K 值进行分析 A4＞A3＞A5＞A2＞A1、B3＞B4＞B2＞B5＞B1、C3＞C4＞C5＞C2＞C1、D3＞D4＞D5＞D2＞D1、E4＞E5＞E3＞E2＞E1、F3＞F2＞F4＞F5＞F1，因此，制备大豆益生元发酵豆乳的最佳配方是A4B3C3D3E4F3，即豆粉与水的质量体积比为 1 ∶12（g/mL）、脱脂乳粉添加量为24 %、SBOS 添加量为25 %、接种量为5 %、发酵温度为37 ℃、发酵时间为7 h、干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌比例1 ∶1、果胶的添加量为0.3%、后熟时间18 h。

方差分析见表4。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.2.2 大豆益生元发酵豆乳验证试验

按上述最佳工艺条件，即干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌比例1 ∶1、果胶的添加量0.3%、豆粉与水质量体积比 1 ∶12（g/mL）、脱脂乳粉添加量 24%、SBOS 添加量25%、接种量5%、发酵温度37 ℃、发酵时间7 h、后熟18 h 进行3 次平行试验。结果显示：3 次试验结果的误差较小、稳定性较好，说明正交试验结果正确可行。大豆益生元发酵豆乳感官评分与益生菌数量如表5 所示。

2.3 发酵豆乳中益生菌数量检测结果

按制备方法制备发酵豆乳，正常对照组蔗糖的接种量为10%；阳性对照组SBOS 接种量为3 包大豆低聚糖冲剂。正常对照组、阳性对照组与大豆益生元发酵豆乳在形成凝乳后，分别于 0、6、12、18、24 h 采用MRS 琼脂平板菌落计数法[15]检测各组分发酵豆乳中益生菌数量。结果如表6 所示。

表5 大豆益生元发酵豆乳验证试验结果Table 5 The results of proving experiment of the soybean prebiotic fermented soymilk

表6 发酵豆乳在发酵过程中不同时段的益生菌数量Table 6 The probiotics amount at different time in fermentation process of fermented soymilks

由表5 可知，随着时间的增加，各组分的发酵豆乳中干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌的数量均有升高，正常对照组益生菌数量升高的幅度最小，含功能性SBOS组益生菌数量升高幅度较大，在凝乳后0～12 h 时，益生菌数量升高速度慢；在12 h～18 h 时，益生菌数量迅速升高。在凝乳24 h 时，阳性对照组益生菌数量达到1.93×1012CFU/mL，是正常对照组的 1708 倍；益生元发酵豆乳100 mL 组益生菌数量达到3.03×1013CFU/mL，是正常对照组的26 814 倍；益生元发酵豆乳200 mL组益生菌数量达到4.73×1013CFU/mL，是正常对照组的41 858 倍；益生元发酵豆乳150 mL 组益生菌数量达到7.93×1013CFU/mL，是正常对照组的70 177 倍。因此，功能性SBOS 作为益生元对于干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌的生长具有增殖作用，食用150 mL/d 大豆益生元发酵豆乳对该益生菌生长具有显著的促进增殖作用（t≤0.05）。

3 结论

按上述制备方法，采用干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌混种发酵大豆低聚糖，优化大豆益生元发酵豆乳制备工艺。通过单因素及正交试验，制备大豆益生元发酵豆乳的最佳工艺条件，即干酪乳杆菌与鼠李糖乳杆菌质量比为1 ∶1、果胶的添加量为0.3%、豆粉与水的质量体积比为1 ∶12（g/mL）、脱脂乳粉添加量为24%、SBOS 添加量为25%、接种量为5%、发酵温度为37 ℃、发酵时间为7 h、后熟18 h～24 h。此条件下制备的大豆益生元发酵豆乳凝乳坚实、细腻、光滑，风味及口感俱佳。食用150 mL/d 大豆益生元发酵豆乳对益生菌生长增殖显著，适于免疫力功能下降的老人、腹泻或便秘人士食用，是一种可以调节肠道有益菌群平衡，保障人体健康的保健型发酵豆乳。