布鲁菌DK63_426基因缺失株的构建及生物学特性研究

李明奇，王小凤，郭嘉，赵天艺，刘航，张樊，吴长新，张辉

(石河子大学动物科技学院/动物疾病防控兵团重点实验室，新疆 石河子 832000)

布鲁菌属α-2变形杆菌家族致病细菌[1]，胞内寄生和繁殖为该菌主要的毒力特征[2]。主要寄生在巨噬细胞内[3]，人畜共患，是一种传播途径广、寄生宿主多的传染性疾病，在世界很多国家和地区广泛流行[4]。布鲁菌的致病机制还不完全清楚，研究其致病毒力因子的生物学功能对揭示布鲁菌的致病机理具有重要意义。布鲁菌毒力因子主要有IV型分泌系统(T4SS)[5]、脂多糖(LPS)、外膜蛋白和Bvr R/BvrS双组分系统。外膜系统是布鲁菌重要的毒力因子，独特的外膜结构可抵抗多种宿主细胞的杀灭作用，布鲁菌外膜系统的结构主要由磷脂、鸟氨酸脂质、脂蛋白和非典型脂多糖(LPS)组成。布鲁菌的LPS不具有经典的结构特征，布鲁菌毒力作用主要与其胞内生存和繁殖力有关[6]。DK63_426基因编码糖基转移酶，参与布鲁菌LPS的生物合成。本研究通过构建DK63_426基因缺失突变株，以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象，分析其生长特点及在细胞中的存活能力，为进一步揭示布鲁菌胞内感染机制的奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、血清、细胞和载体

布鲁菌16 M、S2株，E.coliDH5α，小鼠巨噬细胞 RAW264.7均由新疆地方与民族高发病省部共建重点实验室保存；pMD19-T载体(TaKaRa)，pUC19 K质粒由北京军事医学科学院惠赠。

1.1.2 培养基与主要试剂

布鲁菌培养基(SIGMA)；LB培养基(OXOID)；氨苄霉素、卡那霉素(MERK)；质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒；DNA Marker、2×Es Taq Master mix(TaKaRa)；IL-6 ELISA检测试剂盒、TNF-α ELISA检测试剂盒(R&D)；细胞培养液、曲拉通(Solarbio)。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

根据Genebank中登录的Kan基因和布鲁菌16 M的DK63_426基因上下游同源臂基因，使用 Primer 5.0 软件分别设计Kan基因上下游引物和DK63_426同源臂基因上下游引物(表1)由上海生物工程股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.2DK63_426基因缺失突变株载体的构建

布鲁菌16 M 85 ℃灭活60 min产物为模板，以DK63_426-N-F、DK63_426-N-R为引物扩增上游同源臂。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，66 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，循环数为35个，72 ℃总延伸7 min，最后4 ℃保存；以DK63_426-C-F、DK63_426-C-R为引物扩增下游同源臂。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，65 ℃退火35 s，72 ℃延伸50 s，30个循环；72 ℃总延伸7 min，最后4 ℃保存；以含有Kan抗性的PUC19 K质粒为模板，以Kan-F、Kan-R为引物扩增Kan基因。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，65 ℃退火35 s，72 ℃延伸70 s，30个循环；72 ℃总延伸7 min，最后4 ℃保存。各产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，含有目的基因的胶块根据琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行提取。

将Kan基因和DK63_426基因上下游同源臂3段基因的PCR产物按照1∶1∶1的比例混合作为融合PCR的模板，经两轮PCR反应：第一轮PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，63.8 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，10个循环；72 ℃总延伸10 min，最后4 ℃保存；产物作为第二轮PCR扩增的模板，DK63_426-N-F和DK63_426-C-R作为引物进行PCR扩增，反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，58.5 ℃退火40 s，72 ℃延伸3 min，30个循环；72 ℃总延伸10 min，最后4 ℃保存。反应完成后，PCR 产物在经1% 凝胶中电泳检测，含有目的基因的胶块根据琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒说明书进行提取，转化至E.coliDH5α感受态细胞中，按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，将融合片段与pMD19-T载体质粒进行连接，构建pMD19-T- DK63_426-Kan重组质粒。交由上海生物工程股份有限公司测序。

1.2.3DK63_426基因缺失突变株的构建

pMD19-T- DK63_426-Kan重组质粒电转化到布鲁菌16 M感受态细胞中，并且涂平板于具有Kan抗性的布鲁菌固体培养基上，37 ℃倒置培养3～5 d，在培养基中选取单个菌落并置于新鲜的具有Kan抗性的液体培养基中培养，37 ℃摇菌24 h后取100 μL菌液，85 ℃灭活30 min后作为模板，用外部检测引物(DK63_426-N-F、Kan-R)和内部检测引物(DK63_426-F、DK63_426-R)进行 PCR 扩增，以16 M亲本株作为对照进行鉴定，对于验证成功的重组突变株命名为16 MΔDK63_426。

1.2.4 16 MΔDK63_426遗传稳定性的分析

将16 MΔDK63_426菌液在含有Kan抗性的布鲁菌固体培养基上进行划线培养，选取单克隆菌落传15代，85 ℃灭活，并以此作为鉴定缺失株的 PCR 模板，用外部检测引物和内部检测引物对布鲁菌进行PCR扩增，以16 M亲本株作为对照进行鉴定。产物通过琼脂糖凝胶检测其结果，同时将外部引物获得的片段经回收后，送上海生物工程股份有限公司测序。

1.2.5 布鲁菌 16 MΔDK63_426及其亲本株生长特性检测

分别挑取布鲁菌16 MΔDK63_426、16 M和S2 单克隆菌落于布鲁菌液培养基中，37 ℃培养至OD600nm≈0.8，用新鲜的布鲁菌液体培养基调整到OD600nm≈0.1继续培养，每间隔2 h收取菌液，灭活检测OD600nm值，直至各菌株培养至平台期，绘制布鲁氏菌16 MΔDK63_426、16 M和S2的生长曲线图。

1.2.6 布鲁菌16 MΔDK63_426胞内生存试验

我们将长势良好的RAW264.7传到六孔细胞板中，每孔106个，分别使用生长到对数生长期的 16 MΔDK63_426和亲本株按照侵染复数(MOI)100∶1侵染上述细胞，37 ℃细胞培养箱孵育1 h，弃去培养基，PBS清洗4次，转接含庆大霉素培养基，37 ℃细胞培养箱孵育，待4、8、12、24 h 时弃去培养基，PBS清洗0.1%曲拉通裂解细胞，涂于布鲁菌固体培养基，进行CFU计数。

1.2.7 细胞因子的检测

将16 MΔDK63_426、16 M分别侵染RAW264.7细胞，37 ℃细胞培养箱孵育，待4、8、12、24 h时收集细胞清液，按照IL-6，TNF-α ELISA检测试剂盒说明书方法检测细胞因子释放量。

2 结果

2.1 DK63_426基因缺失突变株载体的构建

2.1.1DK63_426基因同源臂及Kan基因扩增

以布鲁菌16 M为模板，PCR扩增DK63_426基因N端和C端的同源臂序列，获得与预期相符目的条带(图1A，泳道1～3为DK63_426基因N端，泳道4～6为阴性对照，泳道7～11为DK63_426基因C端)；以PUC19 K质粒为模板，PCR扩增Kan基因，获得与预期相符目的条带(图1B)，泳道15为阴性对照。

图1 DK63_426基因同源臂及Kan基因扩增

2.1.2 融合PCR扩增

将获得的三段目的基因：DK63_426基因上游同源臂基因、Kan抗性基因，用融合PCR技术进行融合扩增，结果显示融合基因约为 2091 bp(图2)，泳道7为阴性对照。

图2 融合PCR扩增

2.1.3 缺失突变株载体的构建及鉴定

将融合片段与PMD19-T载体连接，对单克隆进行PCR鉴定，扩展出与预期相符的条带(图3)，泳道5为阴性对照；阳性克隆测序结果与目的基因片段一致。说明成功构建pMD19-T- DK63_426-Kan重组质粒。

图3 缺失突变株载体的构建及鉴定

2.2 DK63_426基因缺失突变株的构建

用外部检测引物(DK63_426-N-F、Kan-R)和内部检测引物(DK63_426-F、DK63_426-R)对电转后的16 M阳性单克隆菌株进行菌液PCR鉴定，结果显示：外部检测只有16 MΔDK63_426出现条带(图4A)，内部检测只有亲本株出现条带，没有回复突变现象(图4B)，表明成功构建DK63_426基因缺失突变株。

注：1：亲本株；2～14：16 MΔDK63_426；15：亲本株；16：阴性对照图4 DK63_426基因缺失突变株的构建

2.3 16 MΔDK63_426遗传稳定性的分析

我们利用外部检测引物(DK63_426-N-F、Kan-R)和内部检测引物(DK63_426-F、DK63_426-R)对16 MΔDK63_426连续传15产物进行PCR扩增，以16 M亲本株作为对照，结果显示：外部检测只有16 MΔDK63_426出现条带(图5A)，内部检测只有亲本株出现条带，没有回复突变现象(图5B)，16 MΔDK63_426可稳定遗传。

注：1～9：16 MΔDK63_426；10：亲本株；11～14：16 MΔDK63_426； 15：亲本株；16：阴性对照图5 16MΔDK63_426遗传稳定性分析

2.4 布鲁菌16 MΔDK63_426 及其亲本株生长特性检测

通过对布鲁菌16 MΔDK63_426及其亲本株的生长曲线可以看出，布鲁菌 16 MΔDK63_426及其亲本株生长趋势基本一致，培养至12 h时所有菌株都已到达对数生长期，到30 h 到达细菌生长平台期(图6)。

图6 16M、16 MΔDK63_426和S2生长曲线

2.5 布鲁菌16 MΔDK63_426侵染RAW264.7细胞 CFU计数

布鲁菌 16 MΔDK63_426与亲本株在侵染RAW264.7细胞4、8、12、24 h进行收样培养，菌落计数可看出布鲁菌 16 MΔDK63_426在侵染RAW264.7细胞12 h胞内存活率显著低于亲本株(P<0.01)，到24 h和亲本株没有显著性差异(图7)。

图7 布鲁菌16 M和16 MΔDK63_426胞内存活能力

2.6 细胞因子的检测

通过ELISA检测细胞因子分泌水平，结果显示：亲本株与缺失株组侵染侵染RAW264.7细胞在4、8、12、24 h细胞因子IL-6、TNF-α均高于PBS对照组，在侵染8 h时IL-6的分泌量缺失株组均显著低于亲本株(P<0.05)；TNF-α的分泌量缺失株组均显著高于亲本株(P<0.05)，在侵染12 h时IL-6的分泌量缺失株组均极显著低于亲本株(P<0.01)；TNF-α的分泌量缺失株组均极显著高于亲本株(P<0.01)，到 24 h和亲本株没有显著性差异(图8、图9)。

结果表明16 MΔDK63_426可诱导炎性细胞因子的分泌且与亲本株有差异。

图8 IL-6的表达量

图9 TNF-α的表达量

3 讨论

布鲁菌是革兰氏阴性菌，其外膜在感染宿主的过程起到关键性作用，外膜的外层结构主要是脂多糖[7]。脂多糖是布鲁菌的主要毒力因子、表面抗原，由OPS、核心多糖和具有内毒素性质的类脂A三个结构域组成[8]，在布鲁菌中的生物合成过程如下：布鲁菌以葡萄糖为原料，转变为其他参与合成的糖分子，在细胞质内随着糖基转移酶的连续酸化，将各类糖基不断加到类脂A骨架上，直到2个KDO残基合成到类脂A中，然后将合成好的类脂A转运到细胞周质；OPS以独立形式在膜内合成，连接类脂A受体糖上，通过ABC系统转运到细胞周质；在细胞周质OPS由特定的连接酶催化绑定到类脂A上[9]。DK63_426基因编码一种糖基转移酶，属于RfaB家族，在大肠杆菌有关研究报道参与LPS的合成[10]。研究该基因的生物学功能将会为揭示布鲁菌LPS的调控机制提供基础。

DK63_426基因作为参与合成LPS的基因，可以影响细菌的生长、胞内生存及炎症反应的能力[11]。病原体侵害机体时会诱发体液免疫与细胞免疫，引起相关介质与细胞因子的表达，导致炎症对机体造成影响[12]。布鲁菌侵染宿主细胞后，会引起先天性免疫和获得性免疫，而获得性免疫主要受一系列细胞因子影响，主要包括：IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ、MIP-1α等[13]，其中TNF- α可诱发代谢变化，可促进相关炎症介质生成[14-15]，IL-6来源巨噬细胞及肿瘤细胞，是一种炎症递质[16]，IL-6和TNF-α表达量是重要的致炎指标。本文中DK63_426基因缺失后TNF-α的表达量显著下降，IL-6表达量有所升高，同为炎症炎症相关的细胞因子在该基因缺失后存在不同的表现形式，这种机制还要通过实验进一步的验证。

由于布鲁菌没有质粒，外源的质粒大多不能在其中复制，很多质粒可以变成自杀载体来完成布鲁菌基因缺失突变株的构建[17]，不同于传统的构建缺失突变株的方法，本研究利用同源重组方法，采用抗性基因交换的方式规避了质粒整合所产生的一系列问题，并且抗性基因的存在直接使构建的缺失株具备筛选标记，能够很容易地获得目的突变株[18-19]，可提高研究目的基因的效率。本研究采用同源重组抗性替换方法构建布鲁菌缺失株遗传性稳定，说明采用抗性基因交换的方式效率高稳定性好。进一步做生长特性检测与胞内生存试验发现缺失株与亲本株生长趋势基本一致，但胞内存活率显著低于亲本株，表明该基因突变后布鲁菌可能无法形成完整的LPS结构，改变布鲁菌维持宿主细胞的存活能力。

本研究采用同源重组方法、利用抗性基因交换的方式成功构建了16 MΔDK63_426，在此基础上进一步探究16 MΔDK63_426与亲本株相比其生长特性、存活能力、促炎作用，证实DK63_426基因的缺失降低了布鲁菌的胞内存活能力，影响相关炎症因子IL-6和TNF-α的表达，这与DK63_426基因功能息息相关，进一步说明了LPS与致炎作用的关系，为布鲁菌感染机制的研究和新型疫苗的研制奠定基础。