ARID1A对结肠癌细胞迁移的调控作用

石 慧， 彭 锐， 邹方东

(四川大学生命科学学院， 成都 610065)

1 引 言

结直肠癌(Colorectal Carcinoma， CRC)包括结肠癌和直肠癌， 两者主要存在解剖学上的区别[1].据2018年统计， 全球新增结直肠癌病例超过180万， 其中881 000例死亡[2-3].调查表明结直肠癌患者手术后5年内生存率在40%～60%之间， 说明手术后癌症可能复发或转移[4].另有很多患者在诊断时已经出现癌细胞向其他脏器转移的现象[5].恶性程度较高的结直肠癌不仅会对化疗药物会产生耐药性， 而且转移几率更高.因此研究结直肠癌发生和转移机制、寻找新的治疗方式和治疗靶点显得尤为迫切.

SWI/SNF染色质重塑复合物由多种亚基构成， 根据核心催化亚基的不同可以分为BAF(BRG1/BRM associated factors, BAF)和PBAF(Polybromo-associated BAF, PBAF)两大类复合物.BAF类复合物核心催化亚基包括具有ATP酶活性的BRM(Brahma, BRM)和BRG1(Brahma related gene1, BRG1)， 该复合物可以利用ATP水解的能量改变核小体的结构和位置， 调节转录因子与启动子之间的结合， 从而激活或抑制转录[6-7].ARID1A(AT-rich interactive domain 1A， ARID1A)是SWI/SNF复合物的一个非催化亚基， 可以非特异性地与DNA结合， 招募其他组分到复合物中.

对结直肠癌样本中ARID1A蛋白水平的临床病理学分析结果显示， 25.8%的原发性肿瘤不表达ARID1A， 51.2%有低水平的ARID1A表达.并且在TNM(tumor-node-metastasis， TNM)一期到四期的肿瘤中ARID1A的缺失率达到7.4%～46.3%.这些数据说明ARID1A在结直肠癌中的缺失与肿瘤的发生和转移有着密切的关系[8].本文通过干扰和过表达ARID1A， 研究其对结肠癌细胞迁移的影响， 并通过GO和KEGG分析参与细胞迁移的ARID1A共表达基因所涉及的生物学过程和信号通路， 以期揭示ARID1A调控细胞迁移的分子机制.

2 材料与方法

2.1 材 料

人结肠癌细胞系HCT116， 人肾上皮细胞系HEK293T购于上海中科院细胞库；质粒pLKO.1-TRC， pSPAX2， pMD2.G， pLenti-puro-ARID1A和pcDNA3.1(+)购于Addgene公司；引物合成及测序由成都擎科梓熙生物技术有限公司完成(引物序列见表1).

2.2 方 法

2.2.1 ARID1A基因干扰载体和过表达载体的构建 通过XhoⅠ和ScaⅠ双酶切， 从pLenti-puro-ARID1A载体上得到ARID1A基因CDS区全长.同时用XhoⅠ酶切pcDNA3.1(+)质粒， 将ARID1A片段与酶切后的pcDNA3.1(+)质粒进行连接， 转化感受态大肠杆菌， 氨苄培养基筛选阳性菌落并测序， 得到ARID1A基因过表达载体；将shRNA-ARID1A-F和shRNA-ARID1A-R引物序列混合后置于98℃水浴变性3min， 自然冷却至室温(退火)， 与AgeⅠ和EcoRⅠ酶切后回收的pLKO.1-TRC载体片段进行连接， 测序鉴定得到ARID1A干扰载体， 同时用shRNA-scramble序列与pLKO.1-TRC载体片段连接作为对照， 与慢病毒载体pSPAX2、pMD2.G共转染HEK293T细胞， 得到病毒浓缩液， 感染HCT116细胞.

2.2.2 RNA提取、反转录与Real-time PCR反应 吸掉细胞培养皿/板中的培养基， PBS缓冲液洗1～2遍， 加入RNAiso Plus， 充分裂解细胞后转移至无RNA酶的1.5 mL离心管中， 加入1/5样品体积的氯仿， 快速振荡混匀， 冰上静置 2 min；静止后可以看到液体分层， 然后4 ℃ 12 000 g离心15 min；吸取上层水相至另一干净无RNA酶的新管中， 加入与液体相等体积的异丙醇；4 ℃ 12 000 g再次离心15 min， 除去上清， 加入预冷的75%的乙醇1 mL洗涤沉淀；4℃ 7 500 g 离心10 min， 吸掉上清， 室温晾干5 min；加入20 μL DEPC水溶解， 按照TaKaRa反转录试剂盒说明书进行cDNA合成.

Real-time PCR反应体系参照Innovagen 2×Taq SYBR Green master mix说明书.

2.2.3 细胞迁移实验 将划痕插件用酒精喷洗后， 自然晾干， 将有粘性的一面放入12孔板中.对数生长期的细胞消化稀释， 计数， 按照插件每室50 000个细胞铺板， 放入培养箱中生长24 h左右， 待细胞贴壁后， 用镊子轻轻拔去划痕插件， 吸掉培养基， PBS洗两遍， 换新的培养基， 在显微镜下拍照记录；拔掉插件后0 h、24 h各记录一次；用Image J软件进行迁移率分析.

2.2.4 ARID1A共表达基因的筛选、GO分析和KEGG分析 从Metabolic gEne RApid Visualizer1在线数据库获取结肠癌细胞系HCT116与结直肠正常组织中的基因表达数据， 筛选出与ARID1A相关系数大于0.9的共表达基因.通过在线数据库DAVID (https://david.ncifcrf.gov/)对这些共表达基因进行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Pathway)通路分析.

3 结 果

3.1 获得ARID1A基因过表达和稳定干扰细胞株

为了观察ARID1A基因过表达对HCT116细胞迁移的影响， 本研究首先从pLenti-puro-ARID1A载体上得到ARID1A基因CDS区全长， 构建了ARID1A-pcDNA3.1(+)真核表达载体.转染HCT116细胞后， 通过实时荧光定量PCR检测ARID1A基因的表达， 结果显示ARID1A在HCT116细胞中表达量显著增加(P<0.01)， 说明成功过表达(图1A).

将ARID1A基因干扰载体测序鉴定正确后(图1B)， 进行慢病毒包装， 并感染HCT116细胞.实时荧光定量PCR检测结果显示ARID1A在HCT116细胞中表达量显著降低(P<0.01)， 说明干扰成功(图1C).

3.2 ARID1A对HCT116细胞迁移的影响

为了探究ARID1A表达量升高或者下降是否会对HCT116细胞的迁移有影响， 用划痕插件制造细胞划痕， 观察ARID1A过表达和ARID1A干扰后细胞迁移情况.实验发现， 与对照组细胞相比， ARID1A过表达会降低细胞迁移率(图2A，P<0.05)， 而干扰ARID1A表达后， 细胞迁移率增加(图2B，P<0.01).

图1 ARID1A过表达载体与干扰载体的构建

Fig. 1 Construction of ARID1A overexpression and interference vectors

A.ARID1A过表达检测结果， 对照组转染pcDNA3.1(+)空载体. B. ARID1A干扰载体测序结果；下划线序列为干扰序列.C. ARID1A干扰检测结果， 对照组用含shRNA-scramble序列的慢病毒感染.**P<0.01.

A.The expression level of ARID1A after overexpression was detected by qPCR. Control group was transfected with pcDNA3.1 (+) empty vector. B. The sequencing result of ARID1A interference vector. ShRNA-ARID1A sequence are underlined. C. The expression level of ARID1A after interference was detected by qPCR. Control group was infected with lentivirus containing shRNA-scramble.**P<0.01.

3.3 ARID1A共表达基因GO富集分析及KEGG通路分析

通过比较结肠癌细胞系HCT116与结直肠正常组织中的基因表达数据， 从中筛选出1 212个相关系数大于0.9的ARID1A共表达基因.利用DAVID 在线工具将这些基因富集到生物学过程和信号通路中.GO分析发现， 参与细胞增殖过程的基因仅有N4BP2L2, ACE, IF2AK2, PDCD2等4个基因， 参与细胞迁移过程的有PTEN, BRAF, IL23A, CCL21, NCKAP1L, LBP, JAM3, SLIT2, CD74, S100A8, PPBP, CCL13, NCKAP1L, WDR1, PTGER4, TMEFF2, SLURP1, COL3A1, DAG1, ARPIN, MIIP, PTPRU, DACH1, ADIPOQ, TRIB1, APOE, NKX2-1, HRG, CNN2等29个基因(图3).KEGG分析发现， 与细胞迁移相关的基因富集于趋化因子信号通路、粘着斑、细胞因子受体相互作用等信号通路.

图2 ARID1A过表达和干扰后细胞的迁移

Fig.2 Cell migration after ARID1A overexpression and interference

A.左图：ARID1A过表达后细胞迁移的变化， 对照组细胞转染pcDNA3.1(+)空载体. 右图：细胞迁移的统计分析.B. 左图：ARID1A干扰后细胞迁移的变化， 对照组用shRNA-scramble的慢病毒感染.右图：细胞迁移的统计分析.*P<0.05，**P<0.01.

A.Left: The cell migration change after ARID1A overexpression in HCT116. The control group was transfected with pcDNA3.1(+) empty vector. Right: The statistical analysis of cell migration. B. Left: The cell migration change after ARID1A interference. The control group was infected with the lentivirus containing shRNA-scramble sequence. Right: The statistical analysis of cell migration.*P<0.05,**P<0.01.

图3 GO分析参与细胞增殖和迁移的ARID1A共表达基因Fig.3 GO analysis of ARID1A co-expressed genes involved in cell proliferation and migration

4 讨 论

染色质重塑对细胞核活动包括DNA复制、转录和DNA损伤修复等多方面有着至关重要的作用.与染色质重塑相关研究已成为癌症发病机制研究的新方向[9-10].随着近年来基因测序技术的迅速发展， 发现在多种人类癌症中存在ARID1A基因突变.在卵巢透明细胞癌中ARID1A的突变率约为57%[11]， 子宫内膜癌中为23%～42%[12]， 结直肠癌中约为10%[13].本文发现在结肠癌细胞HCT116中过表达ARID1A可以抑制细胞迁移， 而干扰其表达后， 细胞迁移率增加.在1212个与ARID1A相关系数大于0.9的共表达基因中， 参与细胞迁移的基因有29个， 这些基因参与趋化因子信号通路、粘着斑、细胞因子受体相互作用等信号通路.

其中， PTEN和BRAF是目前研究较多的与细胞迁移关系密切的基因.PTEN可以负调控AKT， 进而抑制肿瘤进程， 例如调控细胞生长、凋亡、粘附、迁移和侵袭等[14-15].BRAF在小鼠胚胎形成过程中对肢体骨骼肌的形成起着至关重要的作用， 是诱导成肌细胞迁移的重要因子[16].本研究发现在结肠癌细胞中PTEN与ARID1A的表达呈负相关， BRAF与ARID1A的表达呈正相关， 但是ARID1A, PTEN和BRAF在细胞迁移中的调控关系还有待深入研究.

有文献报道， 在胶质瘤细胞中过表达ARID1A， 发现磷酸化的AKT表达量降低[17].在胃癌细胞中缺失内源性的ARID1A， 可以加快细胞的增殖生长以及营养摄入， 并伴随着PI3K/AKT信号的激活， 上调磷酸化的PDK1、AKT、GSK3β、70S6K以及PI3K、PDK1水平.PIK3CA和PDK1是ARID1A参与形成的SWI/SNF复合物的直接转录靶点， 使用分别靶向AKT和PI3K的变构抑制剂MK2206和LY294002， 可以通过下调激活的PI3K/AKT信号， 有效抑制ARID1A缺失的胃癌细胞的生长和葡萄糖摄入[18].这些数据说明， ARID1A与PI3K/AKT信号通路在细胞的生长和增殖过程中存在密切的调控关系， 推测ARID1A可能也通过该信号通路调控细胞迁移， 但是具体机制还需进一步实验证实.

综上所述， 本文发现ARID1A可以抑制结肠癌细胞迁移， 并通过GO分析和KEGG分析， 得到参与细胞迁移过程的与ARID1A相关系数大于0.9的共表达基因及其涉及的信号通路， 为进一步探索ARID1A调控细胞迁移的机制提供了研究方向和理论基础.