CDC27基因在系统性红斑狼疮中的表达和临床意义

罗 清，张 露，黄自坤，李俊明

系统性红斑狼疮(systemiclupus erythematosus，SLE)是一种以大量病理性自身抗体产生为特征并累及全身器官的自身免疫性疾病，其发病机制复杂，为多种基因和环境因素相互作用的结果[1]。迄今为止，已经发现多种基因异常与SLE的发生和发展密切相关[2]。细胞分化周期蛋白27(cell division cycle protein 27，CDC27)是12个不同的亚基组成的细胞周期后期促进复合体(anaphase-promoting complex, APC/C)的其中一个亚基，细胞周期后期促进复合体主要经泛素化作用水解周期蛋白和分离酶抑制蛋白以调节细胞周期和有丝分裂的进程[3]。多项研究[4]发现，cdc27异常表达与细胞的增殖、迁移、分泌等功能相关，并且与垂体柄中断综合征、肿瘤等疾病的发生发展密切相关[5]。目前，国内外并未见关于cdc27与SLE关系的研究报道。该文拟研究SLE外周血单个核细胞cdc27表达情况及其与临床相关性。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集32例2018年1～7月在南昌大学第一附属医院风湿免疫科就诊的SLE患者，入选对象均符合美国风湿病学会(ACR)1997年制订的SLE诊断标准[6]，并排除其他严重疾病，其中女31例，男1例；年龄16～65(41.5±11.7)岁。对照组21例，均为来自于同时间段南昌大学第一附属医院健康体检正常的健康志愿者，其中女19例，男2例；年龄22～59(35.8±8.7)岁。两组性别和年龄差异无统计学意义。详细收集SLE患者的临床表现和相关的实验室检查，并根据这些指标计算SLE疾病活动指数(systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI)[7]。根据SLE的病程将其分为9例早期SLE(病程小于3个月)和23例非早期SLE(病程大于3个月)。入选的32例SLE患者中8例于治疗前后抽取样本进行外周血单个核细胞cdc27检测。本实验经医院伦理委员会批准，患者和健康志愿者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器Ficoll分离液购自美国Sigma公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；去除DNA的PrimeScript TM 逆转录试剂盒、SYBR ® Premix Ex Taq TM购自大连宝生物TaKaRa公司；cdc27及内参基因β-actin引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Nanodrop ND-1000 紫外分光光度计购自美国Nanodrop公司；Applied Biosystems 7500型荧光定量PCR仪器购自美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1外周血单个核细胞提取 采集SLE患者及对照者清晨空腹EDTA抗凝外周血2 ml，6 h内送检。采用Ficoll分离液分离提取外周血单个核细胞，用TRIzol试剂处理，放-80 ℃冰箱保存。

1.3.2总RNA提取 按TRIzol试剂操作说明书提取SLE患者及对照组外周血单个核细胞的总RNA，使用Nanodrop ND-1000紫外分光光度计对获得的总RNA进行定量和质量分析。

1.3.3RT-PCR检测 采用RT-PCR SYBR Green法，以β-actin作为内参进行cdc27的检测。提取外周血单个核细胞总RNA后，取1 μl总RNA，利用PrimeScript反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。采用20 μl反应体系进行检测，PCR引物序列见表1。反应体系包括：1 μl反转录产物、0.5 μmol/L上游引物、0.5 μmol/L下游引物、1×SYBR荧光染料试剂。PCR反应条件为：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，72 ℃、30 s，40个扩增循环。所有样品做3个复孔。RT-PCR使用ABI7500仪器进行。分析待测标本的扩增熔解曲线，均为单峰，无非特异性扩增。根据待测标本的Ct值，采用相对定量法对RT-PCR结果进行分析，计算2-ΔCt[8]。

表1 荧光定量 PCR 引物序列

2 结果

2.1 SLE患者及对照者外周血单个核细胞中cdc27的表达结果如图1所示，SLE组患者外周血单个核细胞的cdc27水平低于对照组，分别为0.049(0.020，0.064)和0.140(0.080，0.200)，差异有统计学意义(Z=126.0，P<0.001)。

图1 SLE组患者和对照组外周血单个核细胞cdc27的表达与对照组比较：**P<0.001

2.2 SLE患者外周血单个核细胞cdc27表达与临床的关系收集SLE患者的红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、血常规各参数、免疫球蛋白G、补体3、补体4、自身抗体、蛋白尿、血尿、脓尿、发热、关节炎、胸膜炎、皮疹等实验室指标和临床表现，分析这些指标与SLE患者外周血单个核细胞cdc27的关系。结果显示，SLE患者外周血单个核细胞cdc27与CRP(rs=-0.462,P=0.009)、ESR(rs=-0.358,P=0.048)、单核细胞数量(rs=-0.386,P=0.029)呈负相关 ，而与其他指标不相关。此外，本文分析了早期SLE与非早期SLE患者外周血单个核细胞cdc27表达，虽然早期SLE患者外周血单个核细胞cdc27表达水平低于非早期，但差异无统计学意义。

2.3 SLE患者外周血单个核细胞cdc27表达与治疗的关系8例SLE患者根据病情严重程度选择相应的治疗1周后，比较治疗前后SLE患者外周血单个核细胞cdc27表达水平，结果如表2所示，治疗后SLE患者外周血单个核细胞cdc27表达水平上调，差异有统计学意义(P=0.005 1)。

表2 SLE患者外周血单个核细胞cdc27表达与治疗的关系

2.4 外周血单个细胞cdc27对SLE诊断价值的评估为了评估外周血单个细胞cdc27对SLE诊断价值，对SLE患者和对照者的外周血单个细胞cdc27表达水平进行ROC分析，结果如图2所示，ROC曲线下面积AUC为0.813(95%CI:0.681～0.944;P<0.001)，Cut-off值为0.071 57，敏感性为81.25%，特异性为80.95%，阳性预测值为86.67%，阴性预测值为73.91%，约登指数为0.622。

图2 SLE组患者与对照组外周血单个细胞cdc27的受试者工作曲线分析

3 讨论

虽然近二十年来，SLE的基础和临床研究取得了很大的进展，生物制剂以及联合治疗策略的使用，使SLE患者的10年生存率由过去不足50%，提高到目前的90%以上，但由于病因及发病机制不完全清楚，也没有特效药物治疗，SLE的缓解率仍然不理想。因此，探寻SLE的病因及发病机制至关重要。

CDC27是APC/C复合物中的一个核心原件，在细胞有丝分裂中发挥着至关重要的作用[3]。课题组之前的研究[9]表明cdc27与自身免疫性疾病相关。此外，文献[10]报道CDC27是TGF-β/Smads通路的一个下游分子，磷酸化CDC27可参与TGF-β诱导的APC/C活化，从而导致相应的抑制基因转录和抑癌作用的发生。而TGF-β作为参与维持免疫和耐受的重要效应分子，已被证实在SLE的发生和发展中发挥着至关重要的作用[11]。故推测cdc27可能参与SLE发病。但关于cdc27在SLE中的作用却鲜有报道。本研究对SLE组患者和对照组外周血单个核细胞cdc27表达水平进行检测，结果发现纳入分析的两组研究对象外周血单个核细胞cdc27不相同，SLE组患者外周血单个核细胞cdc27表达水平显著低于健康对照组，且随着疾病炎症的严重程度的增加而降低，即CRP、ESR等炎症指标越高，SLE组患者外周血单个核细胞cdc27表达水平越低。本研究进一步分析发现，SLE组患者外周血单个核细胞cdc27表达水平与治疗相关，SLE患者经治疗后，其外周血单个核细胞cdc27表达水平明显上升。这些研究结果提示SLE组患者外周血单个核细胞cdc27表达水平与疾病的严重程度相关。

目前SLE的诊断主要依据临床表现和自身抗体，但其临床表现复杂，极易误诊；常用的自身抗体虽然对SLE的诊断特异性较好，但其诊断敏感性都不理想，约10%～60%[12-13]。因此，临床上目前仍缺乏理想的SLE诊断标志物。研究[14]表明，多种SLE相关基因可能作为该疾病评估严重程度的指标以及潜在的诊断标志物。本研究采用ROC曲线分析外周血单个核细胞cdc27的诊断价值发现，SLE患者外周血单个核细胞cdc27的AUC为0.813(95%CI:0.681～0.944;P<0.001)，敏感性为81.25%，特异性为80.95%，对SLE的诊断有一定的参考价值[15]。

综上，SLE患者外周血单个核细胞cdc27表达水平降低，与疾病炎症水平以及治疗相关。此外，本研究显示外周血单个核细胞cdc27表达水平可能作为SLE诊断的潜在指标。但CDC27在SLE中所执行的具体功能还需进一步探究。