铜绿假单胞菌介导的支气管扩张大鼠炎症反应和Th17/Treg表达的研究*

谢衬梨， 曾素芬， 郭庆玲， 赵一菊， 陈立冲

东莞市第五人民医院 1呼吸科， 2中心实验室(广东东莞 523900)

支气管扩张症(bronchiectasis)的特点是气道不可逆性、进行性破坏、扩张，是一种脓性式的呼吸道疾病，是呼吸系统难治性疾病之一[1-2]。支气管扩张症的病程呈进行性发展，并与气道定植细菌引起的肺部慢性炎症有极大关联[3-5]。在我国，导致支气管扩张最常见的致病菌为革兰阴性菌,尤以铜绿假单细胞最为常见，占细菌种类的66%[6]。研究发现，支气管扩张患者存在免疫功能紊乱。其中极为重要且具有代表性的指标为Th类中的辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)、辅助性T细胞1(T helper cell 1，Th1)细胞因子[7-8]。铜绿假单胞菌感染和定植能促进患者的炎症反应，导致恶性循环，最终导致支气管扩张发生,肺功能下降[9]。为了进一步了解铜绿假单胞菌是否导致支气管扩张症免疫功能失调，本研究在2017年4月至2018年9月开展实验，通过铜绿假单胞菌制作支气管扩张症大鼠模型，测定肺功能，观察病理切片，检测免疫因子调节性T细胞(T regulatory cell，Treg)、Th17的表达及炎症因子白细胞介素17(interleukin 17，IL-17)、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、白细胞介素10(interleukin 10，IL-10)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的水平，探讨免疫失衡在支气管扩张发病中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂 Treg及Th17流式试剂盒由美国BD公司提供；IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β ELISA试剂盒由美国Ray Biotech公司提供。

1.2 动物分组与处理 无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级SD大鼠，雌性，150～180 g，30只。检疫合格后，模型组10只大鼠以2%戊巴比妥钠 30 mg/kg 腹腔注射麻醉。仰卧位固定，常规消毒后，选择颈部距唇下3 cm处，作纵向1 cm切口，纵向分离出气管，用镊子固定气管，然后用注射器插入气管中，快速注射铜绿假单胞菌液(10～128CFU/mL)0.5 mL和0.5 mL气体，迅速立起固定板，为了防止大鼠不会由于呛咳而出现窒息，让大鼠处于垂直位中，等呼吸平定后把颈部皮肤缝合；假手术组10只大鼠同样方法气管切开，以注射器插入气管中，快速注射0.5 mL生理盐水和0.5 mL气体，假手术组和模型组大鼠术后皮下注射青霉素1 U/d，连续3 d，以防伤口感染。正常对照组10只大鼠无特殊处理。每只大鼠自由进食和饮水。连续14 d。

1.3 观察指标 (1)每天观察并详细记录大鼠的呼吸状态、毛色、体重等情况。(2)所有动物连续观察14 d，记录动物的一般临床反应和死亡情况。(3)手术后第14天分别处死各组大鼠，取肺组织放入4%甲醛固定。眼球取血留取外周血3 mL置肝素钠管留取全血，3 mL置干燥管留取血清。本实验通过广东省实验动物中心伦理委员会审核。

1.4 相关指标检测

1.4.1 肺功能测定 模型建立后第2天麻醉大鼠、切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织暴露气管，在气管软环骨间环形剪开一小切口，插入气管插管并扎紧，仰卧头低位置于小动物肺功能测定仪密闭体积描记箱内。气管插管一端与动物呼吸机相连。当大鼠呼吸时，肺扩张和收缩改变了向内压力，通过测量向内气体压力间接获取肺容量变化。描记一段平静呼吸后测定用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、0.3 s用力呼吸容积(forced expiratory volume in 0.3 second，FEV0.3)、FEV0.3/FVC和用力呼气峰值流速(forced peak expiratory velocity，PEF)。

1.4.2 组织病理学检测 取戊二醛用石蜡包埋、固定肺组织→切片→苏木素-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色→观察组织学改变→取图(显微镜10×物镜及40×)，每一片取图3个视野，每一个视野不可重复[10]。

1.4.3 外周血淋巴细胞Th17细胞检测 抽取大鼠全血加入肝素钠抗凝管中，并提取单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，200 μL大鼠自身血清重悬后加入2 μL BD GolgiPlug(刺激剂和蛋白转运抑制剂)，在5%CO237℃孵育5 h。PBS洗涤后加入抗体CD3+、CD4+，避光孵育15 min。随后加入BD Fix/Perm固定、破膜，重悬后分样本和对照两个管，在样本管中加入抗体IL-17A，对照管中加入抗体IgG2-APC，4℃避光孵育30 min，洗涤重悬后检测CD3+CD4+IL-17+细胞。

1.4.4 外周血淋巴细胞Treg细胞检测 在对照管中加入抗体CD3+、CD4+，样本检测管中加入抗体CD3+、CD4+、CD25+，两管中再分别加入100 μL肝素钠抗凝血，避光孵育15 min；随后加入2 mL红细胞裂解液，反应15 min后离心，洗涤，随后加入BD TF Buffer固定破核,重悬后在样本管中加入抗体FoxP3，对照管中加入同型对照抗体IgG2-APC，4℃避光孵育40 min，洗涤重悬后检测CD4+CD25+FoxP3+的表达。

1.4.5 采用酶联免疫吸附测定 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)技术检测血清炎症介质IL-17、IL-6、IL-10和TGF-β1的检测(按实验操作步骤)：制备好标准曲线，分别在孔板中加入标准曲线和血清样本各100 μL，摇床孵育2.5 h；洗板，加入抗体，孵育1 h，洗板，拍干，加入100 μL酶，孵育45 min，再洗板拍干，每孔加入底物孵育30 min后加入终止液，立刻在酶标仪(Thermo公司)上，以450 nm波长检测吸光度，绘制标准曲线，计算样本的OD值。

2 结果

2.1 一般情况 假手术组与正常对照组饮食无明显改变，活动正常；模型组未见无明显寒战及体温升高，饮食活动略有减少，无大鼠死亡。

2.2 肺功能 与正常对照组和假手术组比较，模型组肺功能参数FVC、FEV0.3、PEF均显著降低,FEV0.3/FVC比值升高，差异有统计学意义(P<0.05)，考虑支气管扩张引起肺限制性通气障碍可能。见表1。

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组别nFVC (mL)FEV0.3 (mL)FEV0.3/FVCPEF(mL/s)正常对照组109.9±1.1∗8.2±1.9∗0.8±0.3∗41.6±5.3∗假手术组109.7±1.5∗8.3±2.1∗0.8±0.2∗40.8±4.4∗模型组106.6±1.66.5±1.51.0±0.434.7±4.8

注：*与模型组比较P<0.01

2.3 肺组织病理学改变 在光镜下正常对照组及假手术组见气管内的支气管组织中，层次是清晰的，纤毛、上皮细胞为整齐排列，且未见有渗出物，管腔内外未见炎性细胞浸润灶，腔内偶见分泌物，肺泡组织清晰，肺泡壁无增厚，未见异常浸润或增生。模型组：大鼠的支气管管壁中，可见有不同程度断裂、破坏，并有局部溃疡形成，扩张明显的是管腔，同级支气管中且腔内还可见局部的炎性细胞，且有滤泡增生。部分的支气管在血管内，可明显见出血、充血现象，且在血管四周，可见很多炎性的浸润。肺泡腔及肺间质内大量炎性细胞浸润，病变区肺泡结构破坏，肺泡壁变薄、甚至断裂融合成大疱，部分肺泡腔内有不同程度的出血。见图1。

2.4 血清炎症因子表达水平 分别与正常对照组、假手术组比较，模型组大鼠的血清IL-17明显升高(P<0.01)、IL-6 明显升高(P<0.01)、IL-10明显降低(P<0.01)、TGF-β明显降低(P<0.01)。见表2。

2.5 免疫因子表达结果 模型组与正常对照组、假手术组比较，Th17表达明显升高[(1.5±0.6)%vs(0.3±0.2)%，P<0.01；(1.5±0.6)%vs(0.4±0.3)%，P<0.01]，Treg 表达明显降低[(8.5±1.5)%vs(15.6±1.3)%，P<0.01；(8.5±1.5)%vs(15.7±2.1)%，P<0.01]。Th17/Treg比值升高(0.18±0.11vs0.019±0.010，P<0.01;0.18±0.11vs0.020±0.013，P<0.01)。见表3。

3 讨论

细菌感染是支气管扩张症急性发作的主要诱因,对于重症患者而言，细胞功能易发生免疫低下，造成了严重的炎性介质反应，加重病情[11]。支气管扩张患者痰液检出细菌中以革兰阴性菌(78.6%)为主，其中铜绿假单胞菌最多(28.6%)[12]。在抗生素治疗、侵入性操作等状态下，定植的细菌种类发生改变，一些强致病菌发生定植，触及了气道上皮细胞发生炎症反应，释放了酶、炎症介质、气道炎症转成慢性疾病，持续一段时间后，导致肺组织、支气管壁损伤，气道中的纤毛上皮清洁功能被破坏。由此，肺的防御功能被破坏。感染反复不康复，加重细菌定植、感染，此恶性循环周而复始[13-15]。晚期，或反复运用抗生素开展治疗之后，最常见的也是铜绿假单胞菌的感染[16]。本研究发现，正常对照组及假手术组肺组织结构清晰，未出现明显形态学改变。铜绿假单胞菌介导支气管扩张大鼠模型组的支气管管壁中，可见有不同程度断裂、破坏，并有局部溃疡形成，扩张明显的是管腔，同级支气管中且腔内还可见局部的炎性细胞，且有滤泡增生。部分的支气管在血管内，可明显见出血、充血现象，且在血管四周，可见很多炎性的浸润。肺泡腔及肺间质内大量炎性细胞浸润，病变区肺泡结构破坏，肺泡壁变薄、甚至断裂融合成大疱，部分肺泡腔内有不同程度的出血。

早期的研究证实了支气管扩张后T淋巴细胞功能异常，是一项重要指标，且具有代表性的为Th类中的Th17、Th1细胞因子[17-18]。Jaat等[19]研究发现铜绿假单胞菌定植可导致支气管扩张T淋巴细胞功能减低。Th17细胞主要分泌IL-17A、IL-6等细胞因子，可趋化中性粒细胞进入肺组织释放中性粒细胞弹力蛋白酶破坏肺组织，加剧气道炎症[20-23]。Treg分泌细胞因子直接接触，如TGF-β等，对炎症反应、抗原特异度抑制，让免疫保持自稳状态，Treg细胞是介导免疫类的，此细胞和介导炎症反应Th17细胞，在分化、功能方面是互相拮抗的，两者制约、确保机体免疫平衡。初始的CD4+T细胞在接受了抗原刺激之后，不同条件会分化不同亚型的T细胞，所执行的功能也不一样，通常可见Th1、Th2、Th17三种[24]。例如Th17，在IL-6存在时，初始细胞可分化成Treg，并对TGF-β1有一定依赖性；在诱导中加入IL-6，其抗体促进Foxp3+Treg细胞分化，机体无损伤、无炎症时，免疫系统产生的TGF-β1，对T细胞增殖明显抑制，促进Treg细胞表达，保持着机体的免疫耐受，但有感染、炎症时，IL-6会大量产生并抑制着Treg细胞表达，和TGF-β1一起诱导着Th17细胞分化，以此介导着机体前炎症反应[25]。本研究结果显示，与正常对照组比较，本研究结果显示，铜绿假单胞菌介导支气管扩张大鼠CD4+Th17表达升高，CD4+CD25+Foxp3+Treg表达降低，Th17/Treg比值升高，模型组血清IL-17、IL-6水平明显升高，IL-10、TGF-β1表达显著降低(P<0.01)。说明Th17、Treg可能共同参与支气管扩张的发病过程。此研究显示，Th17/Treg失衡或许是支气管扩张所发生的重要机制，Th17细胞分泌IL-17参与支气管扩张炎症反应过程，促IL-6因子释放，前体的细胞继续分化、失衡，造成肺组织又出现了损伤。本研究还发现，与正常对照组和假手术组比较，支气管扩张模型组肺功能参数FVC、FEV0.3、PEF均显著降低,FEV0.3/FVC比值升高，差异均有统计学意义，考虑支气管扩张引起肺限制性通气障碍可能。

图1 各组病理结果(HE)

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组别IL-17(ng/L)IL-6(ng/L)IL-10(ng/L)TGF-β(ng/L)正常对照组0.3±0.2∗2.3±2.1∗14.3±1.3∗90±9.4∗假手术组0.5±0.3∗2.7±2.5∗14.8±1.6∗92±8.6∗模型组2.5±0.88.1±0.98.8±1.436±5.6

注：*与模型组比较P<0.01

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组别Th17(%)Treg(%)Th17/Treg正常对照组0.3±0.2∗15.6±1.3∗0.019±0.010∗假手术组0.4±0.3∗15.7±2.1∗0.020±0.013∗模型组1.5±0.68.5±1.50.180±0.11

注：*与模型组比较P<0.01

综上所述，自身免疫功能失衡可能导致支气管扩张炎症的发生，支气管扩张炎症存在 Th17/Treg表达失衡，导致CD4+T细胞分化异常，从而打破机体的自身免疫调节，使炎症因子分泌增多，加剧、启动支气管炎症反应，最后造成肺组织损伤、肺功能降低。因此，采取措施平衡Th17/Treg比值，有望成为治疗Th17/Treg的新途径。