非小细胞肺癌患者血清PD-1基因 rs41386349多态性与临床特点相关性

黄德良， 胡莹

广州现代医院肿瘤科8病区(广东广州 511400)

肺癌，在我国男性群体，发病率和病死率居恶性肿瘤之首，为引起男性癌症死亡的主要原因，在女性群体，发病率仅次于乳腺癌，病死率居首位[1]，严重威胁着人类的身体健康。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)构成了不同个体对同质群体中慢性复杂疾病(包括恶性肿瘤)的易感性，以及不同个体对药物和环境因素不同反应的遗传基础[2-4]。通过研究 SNP与疾病易感性、单基因疾病表型和药物疗效的相关性，可以进一步探讨人类疾病的遗传基础。既往对程序性死亡因子-1(PD-1)基因多态性与疾病关系的研究发现，PD-1基因多态性与不同疾病的发病风险间的关系不尽相同[5-6]。rs41386349位点为PD-1启动子多态性位点，其与PD-1基因启动子活性密切相关。已有研究发现[7],PD-1 rs41386349位点基因多态性与肾癌的发病相关，该位点的突变增加了肾癌的发病风险，但PD-1 rs41386349在非小细胞肺癌(NSCLC)中发挥的功能并不为人熟知。如果能发现PD-1基因rs41386349位点与NSCLC微环境中影响抗肿瘤免疫应答诸多因素间的关系，便可间接监测NSCLC患者抗肿瘤免疫应答功能的变化，以进一步筛查肺癌易感人群，制定合理治疗方案和预后具有重要的意义，目前尚未见PD-1 rs41386349基因多态性与NSCLC发病风险的研究报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究共纳入符合条件的NSCLC患者50例，病例来源于2017年6—12月间我院收治的患者，均经电子支气管镜、经皮肺穿刺、痰脱落细胞检查、胸腔积液细胞学检查和(或)手术病理确诊。同时纳入47例健康受试者(健康对照组)，所有患者及健康受试者均签署知情同意书。本研究得到医院伦理委员会批准。

1.2 入选标准 (1)经组织学或细胞学确诊为NSCLL的患者；(2)每例患者均有详细的临床病理特征数据。

1.3 排除标准 (1)病理学确诊为小细胞肺癌；(2)仅有临床诊断的肺癌；(3)无详细的临床病理特征数据；(4)有输血史，放疗和(或)化疗史，合并其他肿瘤者以及有家族遗传病史。

1.4 对照组纳入标准 健康人群，无肿瘤史。

1.5 主要试剂与仪器 PCR DSMIX(广州东盛生物技术有限公司)、台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、单面工作超净台(苏州净化设备有限公司)、普通PCR仪器(杭州朗基科学仪器有限公司)、核酸浓度测定仪(中国，MERINTON)、电泳仪(北京六一)、JS-680B凝胶成像仪(上海培清)。

1.6 聚合酶链反应(PCR) 测PD-1基因SNP。

1.6.1 血标本的收集 每个受试者抽取空腹血清放于真空EDTA抗凝管中，并分装在1.5 mL冷冻管中，-20℃储存、备用。

1.6.2 DNA的提取(按照HiPure Blood DNA Mini Kit提取) 用移液器取200 μL血液加到灭菌做好标记的EP管中，加入1 mL红细胞裂解液充分混匀10 s，室温静置10 min，8 000×g离心3 min，弃上清。向EP管中加入Buffer ATL 230 μL，Proteinase K 20 μL，涡旋混匀。55℃水浴3 h。水浴期间偶尔旋涡混匀。加入10 μL RNase Solutin(50 mg/mL)至消化液中混匀。室温下静置15～60 min降解RNA。10 000×g离心3 min后，将上清液移至新的1.5 mL离心管中。加入Buffer DL 250 μL至消化液中，以最高速度漩涡混匀30 s后，70℃水浴10 min。加入250 μL无水乙醇至消化液中，以最高速度漩涡混匀30 s。将HiPure gDNA Mini Column装在2 mL收集管中，10 000×g离心1 min。丢弃流出物并将柱子重新装回收集管中，加入Buffer GW1(已用乙醇稀释) 500 μL至柱子中，10 000×g离心1 min。丢弃滤液并将柱子重新安装回收集管，加入Buffer GW2(已用乙醇稀释) 650 μL至柱子中，10 000×g离心1 min。丢弃流出物并将柱子重新安装回收集管中，再加入Buffer GW2(已用乙醇稀释) 650 μL至柱子中，10 000×g离心1 min。丢弃流出物并将柱子重新安装回收集管中，10 000×g离心2 min。这一步可去除柱子中残留的乙醇。将柱子装在新的1.5 mL离心管中，将50～100 μL预热至70 ℃的缓冲液AE或灭菌水加入柱子的膜中心，静置3 min，10 000×g离心1 min。再加入50～100 μL预热至70℃的Buffer AE 或灭菌水至柱子的膜中央。静置3 min，10 000×g离心1 min。丢弃DNA结合柱。

1.6.3 PCR产物质量鉴定及测序 测DNA浓度用1.0琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物，以显示透明的PCR产物条带。见图1。Marker为DNA DS2000；rs41386349扩增目标片段大小为422 bp。电泳图显示清晰的目标带(Marker上样量为3 μL，样品上样量为3 μL)。然后进行PCR产物测序、 PCR模板制备。反应结束后使用酒精沉淀的方法纯化DNA片段，最后加入HIDI变性DNA片段上机测序，待测序反应结束后拷贝测序结果并分析。测序结束后使用BioEdit Sequence Alignment Editor进行测序结果判读分析。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件，采用Hardy-Weinberg平衡检验对PD-1等位基因频率分布进行检验；采用行×列表的2检验NSCLC患者与健康对照组基因型频率分布；采用2分析PD-1 rs41386349基因多态性与NSCLC发病的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-1 rs41386349位点遗传平衡检验 健康对照组进行Hardy-Weinberg平衡试验，结果发现，PD-1基因rs41386349位点中C等位基因的频率为0.808 5，T等位基因频率为0.191 5，计算出2=0.464 5，P>0.05。因此，该基因型分布符合遗传平衡定律，具有群体代表性。见表1、图1。

注：数字1～50代表样本数

2.2 PD-1 rs41386349位点的等位基因分布频率 NSCLC组50例受试者PD-1 rs41386349位点等位基因C和T的频率分别为0.65和0.35。健康对照组47名健康受试者中等位基因C和T的频率分别为0.808 5和0.191 5。经2检验，两组间等位基因频率分布存在差异(P<0.01)。见表2。

表1 PD-1 rs41386349 位点基因型的实际频数和预计频数

2.3 PD-1 rs41386349位点的基因型分布规律 PD-1 rs41386349位点基因型频率在NSCLC组和健康对照组中的分布,其中NSCLC组50例受试者测得CC型23例(46%)，CT型19例(38%),TT型8例(16%)；健康对照组47例受试者测得CC型30例(63.84%),CT型16例(34.04%),TT型1例(2.13%)。两组基因型构成比比较，差异有统计学意义(2=6.539 6，P<0.05)。以CC基因型作为参考，CCvsCT，差异无统计学意义(2=1.002，P>0.05；OR=0.646，95%CI=0.275～1.524)；CCvsTT，差异有统计学意义(2=4.679，P<0.05；OR=0.096，95%CI=0.011～0.822)。见表3、图2。

图2 PD-1 rs41386349位点不同基因型

表2 PD-1 rs41386349位点的等位基因型在NSCLC和健康对照组间的分布及风险评估频数(%)

表3 PD-1rs41386349等位基因型在NSCLC和健康对照组间的分布 例(%)

2.4 PD-1 rs41386349基因多态性和NSCLC患者临床相关因素研究 PD-1基因rs41386349 C/T SNP与NSCLC患者临床分期、病理分型、淋巴结转移情况比较，差异有统计学意义(P<0.05)；而与NSCLC患者年龄、性别、肿瘤浸润深度、远处转移情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

图3PD-1rs41386349等位基因型在NSCLC组和健康对照组间的分布

表4 PD-1 41386349基因型分布与NSCLC患者病理参数的关系 例

3 讨论

据世界卫生组织国际癌症研究署(IARC)2015年发布的癌症报告[7]显示：2012年全球约有180万肺癌新发病例，居全球恶性肿瘤第一。迄今为止，其机制还没有被完全阐明。NSCLC作为肺癌的主要类型，围手术期铂类化疗的生存率仅比单纯手术高5.4%，同时3级或以上毒不良反应率超过60%[8-9]。因此，必须力求寻找传统方法之外的其他治疗手段。近年来，肿瘤的免疫疗法备受瞩目，PD-1/PD-L1通路为癌症患者提供了一个重要的治疗靶点，在一些NSCLC患者中，取得了令人瞩目的成果[10-14]。阻断PD-1/PD-L1通路能有效促进肿瘤特异度 CD8+T 细胞对肿瘤组织的浸润，分泌肿瘤杀伤因子，同时还可以增强T细胞的肿瘤抗原启动作用，从而抑制了免疫应答的发生，增强了肿瘤微环境对机体正常免疫的抵抗作用，抑制肿瘤的生长[15-18]。

国内外最近的研究表明 PD-L1 的SNP可能与多种肿瘤发病风险有关[19-24]。SNP可以发生在启动子、编码区、3′-UTR等的任何部位，因而可能会影响机体的表型及其对疾病的易感性。目前，有关PD-1基因SNP与NSCLC相关性的研究较少。Sasaki等[25]分别研究了位于启动子区的PD-1 rs36084323及内含子2区的PD-1rs34819629 SNP 与NSCLC临床病理参数和预后(生存期)的相关性。研究显示，rs36084323 GG单倍型在肺腺癌和肺鳞状细胞癌以及其他类型的NSCLC之间没有差异， GG单倍型与性别、年龄、吸烟情况以和病理分期之间没有相关性。然而，rs36084323 GG单倍型患者的生存期低于GA/AA单倍型患者。rs34819629 GG单倍型患者的生存期低于GA/AA单倍型患者，rs34819629 GG单倍型在病理分期及性别的比较上显著相关。肺腺癌患者rs34819629 GG单倍型的存活率与GA/AA单倍型患者的存活率无差异;此外，在肺鳞癌患者中，rs34819629 GG单倍型患者的存活期低于GA/AA单倍型患者。该研究表明PD-1 SNP与肺鳞癌的预后相关，尤其是早期鳞状细胞癌患者。

我们采用PCR法对PD-1 rs41386349 SNP与NSCLC易感性的关系进行研究。结果显示：(1)PD-1 rs41386349位点存在3种基因型别，分别为CC、CT、TT型，经2检验检测NSCLC组合健康对照组等位基因频率，差异有统计学意义，提示两组基因频率分布存在差异。(2)NSCLC组测得CC型占46%，CT占38%，TT占16%；健康对照组测得CC型为63.84%，CT型为34.04%，TT型为2.13%，比较两组基因型，差异有统计学意义。进一步比较分析，初步发现CC基因型与NSCLC的发病风险呈负相关性(OR=0.096，95%CI=0.011～0.822)。此外，我们还研究了PD-1 rs41386349 SNP与NSCLC患者临床病理参数之间的关系：发现PD-1 rs41386349基因型与NSCLC患者的临床分期、病理分型、淋巴结转移情况有关，与NSCLC患者年龄、性别、肿瘤浸润深度、远处淋巴结转移情况无关。

因此，通过本次研究，我们发现PD-1 rs41386349位点CC型与NSCLC的发病风险呈负相关，且PD-1 rs41386349 SNP与NSCLC患者临床分期、病理类型和淋巴结转移有关。但是本研究还存在一定局限性：由于条件限制，纳入例数偏少，导致本研究结果意义有限，结论较初步。该位点的具体功能以及对NSCLC的影响方式还需今后的细胞和动物实验进行证实。

综上所述，本研究发现 PD-1 rs41386349 SNP与NSCLC易感性和预后的关系。为今后针对NSCLC患者以 PD-L1 为靶点的免疫治疗提供新的思路。