亚精胺诱导小鼠卵巢组织氧化损伤的作用

姜冬梅，康波

(四川农业大学动物科技学院，四川 成都 611130)

生物体内的多胺(腐胺、亚精胺和精胺)含量受到精密而严格的调控[1-2].多胺分解代谢过程中可产生多种活性醛(如丙烯醛)和H2O2，而这些物质累积过多会对细胞造成氧化损伤[3].此外，多胺分解代谢产物还可通过损伤细胞来促使游离多胺的释放，进一步激活氧化分解代谢途径，使损伤加剧[4-5].因此，机体内过量的多胺具有诱导细胞氧化应激的作用[6-9].研究表明，0.15 mmol/L亚精胺可通过其代谢产生的H2O2来抑制FM3A细胞增殖[10].Kwak等[11]研究表明，外源性亚精胺和精胺会使得多胺氧化代谢加剧，从而激活Nrf2-Keap1-ARE抗氧化应激信号通路，进而影响小鼠角化细胞中依赖还原型辅酶(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1)的表达.Yang等[12]利用亚精胺处理人内皮细胞的结果表明，亚精胺通过提高内皮细胞中活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平来上调血红素氧合酶(heme oxygenase,HO-1)的转录和翻译.总之，机体内过量多胺可在胺氧化酶的作用下分解产生丙烯醛和H2O2，而外源性亚精胺可诱导多种细胞氧化应激，甚至造成氧化损伤.

研究表明，氧化应激在女性生殖系统功能的维持和生殖疾病(如子宫内膜异位症、多囊卵巢综合征和不明原因的不孕症)的致病过程中具有重要作用[13].如前所述，外源性亚精胺可诱导离体细胞的氧化损伤.然而，在体水平上，外源性亚精胺诱导哺乳动物卵巢氧化损伤的作用机制尚未见报道.因此，本研究用不同质量分数亚精胺腹腔注射成年雌性小鼠，研究亚精胺对小鼠卵巢组织形态、过氧化物酶(catalase,CAT)活性、丙二醛(molondialdehyde，MDA)水平以及氧化应激相关基因表达量的影响，从在体水平上探究亚精胺对小鼠卵巢组织氧化损伤的作用，以期为进一步研究亚精胺诱导卵巢组织氧化损伤的作用机制提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品采集

选取雌性健康昆明小鼠(SPF级试验用昆明系小鼠，购于成都达硕实验动物有限公司)，常规分笼饲养，小鼠自由采食.6周龄时，将小鼠随机分为4组，每组8只，分别腹腔注射生理盐水(CK)和0.05、0.10、0.15 mg/g(体质量)亚精胺.注射亚精胺后24、48 h时颈部脱臼处死小鼠，迅速采集小鼠卵巢组织，用生理盐水洗净，滤纸吸干后，每组取部分卵巢组织样品用4%多聚甲醛固定，其余样品置于-80 ℃冰箱保存.亚精胺购于Sigma公司，4%多聚甲醛购于碧云天生物有限公司.

1.2 卵巢组织形态学检测

卵巢组织在4%多聚甲醛中固定24 h后，取出组织进行石蜡包埋和切片(片厚4 μm)，苏木精-伊红染色，用中性树胶封片后，于倒置光学显微镜(Nikon，Japan)下进行卵巢组织形态学观察并进行图像采集和分析.

1.3 卵巢组织中CAT酶活性和MDA水平检测

取冻存卵巢组织，加入预冷的PBS后，使用电动匀浆器研磨匀浆，4 ℃，3 000 r/min离心10 min后取上清液，参照BCA蛋白浓度检测试剂盒(碧云天生物有限公司，上海)测定蛋白浓度后，按照CAT活性和MDA含量检测试剂盒(碧云天生物有限公司，上海)说明书检测，并计算小鼠卵巢组织中CAT活性和MDA水平.

1.4 实时荧光定量PCR检测

参照RNAiso Plus试剂盒(TaKaRa公司，大连)说明书提取小鼠卵巢组织总RNA，然后参照反转录试剂盒说明书(TaKaRa公司，大连)将总RNA样品反转录成cDNA模板，置于-20 ℃冰箱中保存，备用.根据GenBank数据库，采用Primer premier 5.0和Oligo 6.0软件分别设计超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、CAT、NQO1和HO-1基因特异性引物(见表1)，华大基因有限公司合成相应引物.实时荧光定量反应体系(10 μL)：iQTMSYBR Green Supermix(Bio-Rad，北京)5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，cDNA模板0.5 μL，用无RNA酶水补足至10 μL.反应条件为95 ℃预变性3 min；95℃变性10 s，57～64.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s(采集荧光)，40个循环；95 ℃保持10 s，绘制溶解曲线.用β-ACTIN基因作为内参基因.每个样品设3个重复.

表1 荧光定量 PCR 引物序列

1.5 数据处理

采用2-△△Ct法处理荧光定量数据，计算各处理组卵巢组织中目的基因相对表达量.利用SAS9.2统计分析软件MEANS过程进行描述性统计分析，ANOVA过程进行方差分析和Duncan’s多重比较，数据用Mean±SEM表示.

2 结果与分析

2.1 亚精胺对小鼠卵巢组织形态的影响

亚精胺处理24 h时，0.05 mg/g亚精胺处理组和对照组小鼠卵巢形态规整，可见各级发育的卵泡，皮质区原始卵泡、生长卵泡及成熟卵泡数量及形态正常，颗粒细胞形态较完整，排列整齐(图1A～1B)；0.10 mg/g亚精胺处理组小鼠卵巢组织中部分卵泡形态和颗粒细胞排列不规整(图1C)；0.15 mg/g亚精胺处理组小鼠卵巢组织中原始卵泡数量较对照组有所增加，且部分卵泡形态结构异常，卵母细胞皱缩且形态异常，颗粒细胞排列紊乱，部分卵泡膜损伤(图1D).亚精胺处理48 h时，0.05 mg/g亚精胺处理组和对照组小鼠卵巢形态无明显差异(图1E～1F)；0.10 mg/g亚精胺处理组小鼠卵巢组织中部分卵泡形态和颗粒细胞排列不规整(图1G)；0.15 mg/g亚精胺处理组小鼠卵巢组织中原始卵泡数量有所增加，且部分卵泡形态结构异常，卵母细胞皱缩且形态异常，颗粒细胞排列紊乱，部分卵泡膜损伤(图1H).

A、B、C、D分别为对照组、0.05、0.10、0.15 mg/g亚精胺处理24 h后小鼠卵巢HE染色切片结果；E、F、G、H分别为对照组、0.05、0.10、0.15 mg/g亚精胺处理48 h后，小鼠卵巢HE染色切片结果.A,B,C and D represent ovarian HE staining in mice treated with the normal saline,0.05、0.10 、0.15 mg/g spermidine for 24 h,respectively；E,F,G and H represent ovarian HE staining in mice treated with the normal saline,0.05,0.10 and 0.15 mg/g spermidine for 48 h,respectively.图1 亚精胺对雌性小鼠卵巢组织形态的影响(HE×100)Figure 1 Effect of spermidine on ovarian histology in female mice(HE×100)

2.2 亚精胺对小鼠卵巢组织CAT活性和MDA水平的影响

由图2可知，0.15 mg/g亚精胺处理24 h时，小鼠卵巢CAT活性极显著低于对照组(P<0.01)；0.10、0.15 mg/g亚精胺处理48 h时，小鼠卵巢CAT活性显著低于对照组(P<0.05)，其余亚精胺处理组小鼠卵巢组织CAT活性与对照组均无显著差异(P>0.05).0.15 mg/g亚精胺处理24 h时，小鼠卵巢MDA水平极显著高于对照组(P<0.01)，其余亚精胺处理组小鼠卵巢组织MDA水平与对照组均无显著差异(P>0.05).

2.3 亚精胺对小鼠卵巢组织氧化应激相关基因表达的影响

由图3可知，0.15 mg/g亚精胺处理组小鼠卵巢CAT、SOD、NQO1和HO-1基因mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.01).其余各处理组抗氧化酶基因mRNA水平与对照组相比无显著差异(P>0.05).

*表示差异显著(PP* indicates significant difference (PP图2 亚精胺对雌性小鼠卵巢组织CAT活性和MDA水平的影响Figure 2 Effect of spermidine on the activity of CAT and content of MDA in ovaries of female mice

图3 亚精胺对小鼠卵巢组织氧化应激相关基因表达的影响Figure 3 Effect of spermidine on the expression levels of genes related to oxidase stress in ovaries of female mice

3 讨论

亚精胺是自然界广泛存在的一种低分子量的脂肪族化合物.生物体内适量多胺可发挥抗氧化应激的功能，然而当多胺过量时会通过多胺分解代谢途径产生丙烯醛和H2O2，进而造成氧化损伤.卵巢氧化损伤可阻滞卵母细胞成熟和卵子发育，甚至会造成卵泡闭锁，严重影响雌性动物的生殖功能.Wang等[14]研究发现小鼠卵巢发生氧化损伤时，卵巢组织结构遭到破坏，卵巢中结构完整的卵泡数量减少，卵泡发育停滞，初级卵泡数量明显增加.曹燕花等[15]研究表明小鼠卵巢氧化损伤会抑制卵泡发育成熟，进而导致卵巢组织中初级卵泡数量增加.本研究发现，随着亚精胺处理浓度的增加或亚精胺处理时间的增长，小鼠卵巢组织呈现出了上述研究相似的表型变化，如卵巢组织形态愈发不规整，初级卵泡数量显著增加，卵母细胞皱缩，卵泡颗粒细胞排列紊乱等.已有研究证实，亚精胺可诱导大鼠视网膜色素上皮细胞和小鼠颅脑氧化损伤[16-17]，而本研究结果表明一定浓度的亚精胺也可诱导小鼠卵巢组织氧化损伤.

机体内许多病理现象均与自由基引起的脂质过氧化密切相关[18-19].CAT是机体酶抗氧化系统中的重要酶，具有清除H2O2，间接抑制脂质过氧化和细胞膜损伤的作用.MDA是脂质过氧化反应的重要产物，可引起蛋白质和核酸等生物大分子的交联聚合，且具有细胞毒性，导致细胞损伤[20-21].MDA含量可反映机体脂质过氧化的程度，因此可作为评价细胞损伤的指标[22-23].研究表明，机体发生氧化损伤时通常伴随着CAT活性的下降及MDA水平的升高[24-25].本研究发现，0.15 mg/g亚精胺处理24 h时，小鼠卵巢组织CAT活性显著低于对照组，同时MDA水平显著高于对照组，这与上述研究结果相一致，说明0.15 mg/g亚精胺处理可导致小鼠卵巢组织发生脂质过氧化，进而造成卵巢组织氧化损伤.此后，随着亚精胺处理时间的增长，0.10、0.15 mg/g亚精胺处理卵巢组织CAT活性均显著低于对照组，这说明亚精胺诱导小鼠卵巢氧化损伤不仅表现为剂量效应也表现为时间效应.然而，本研究还发现不同浓度亚精胺处理48 h时，小鼠卵巢组织MDA含量与对照组均无显著变化，其原因仍有待进一步研究阐明.

如前所述，外源性亚精胺可导致多胺分解代谢加剧，进而提高NQO1和HO-1转录和翻译[11-12].本研究发现，0.15 mg/g亚精胺处理24、48 h时，小鼠卵巢组织NQO1和HO-1基因表达量均显著高于对照组，进一步从在体水平证实了高剂量亚精胺可通过加剧多胺分解代谢途径以促进NQO1和HO-1基因的转录.此外，本研究还发现0.15 mg/g亚精胺处理显著增加了CAT和SOD基因转录.我们前期研究发现[26]，腹腔注射0.15 mg/g亚精胺时，处理组小鼠卵巢组织亚精胺含量不但没有增加，反而显著低于对照组，说明为维持多胺稳态，卵巢组织加速了亚精胺分解代谢.这个过程势必导致卵巢组织多胺代谢产物丙烯醛和H2O2累积，后者诱导卵巢组织产生氧化应激，进而促进了机体抗氧化系统中CAT和SOD基因表达以缓解氧化应激.

4 结论

0.15 mg/g亚精胺可通过抑制CAT活性，降低卵巢组织抗氧化能力，诱导小鼠卵巢组织脂质过氧化，进而造成小鼠卵巢组织氧化损伤.