紧密连接蛋白claudin-1在皮肤基底细胞癌组织中的表达

黄秋红，潘永年，钱 昇，蓝 吉

claudins蛋白是一类跨膜蛋白家族，在人体多种组织中均有表达，具有维持紧密连接的屏障功能和栅栏功能，若其表达异常可导致上皮细胞及内皮细胞的结构破坏，极性丧失，细胞间黏附力下降，进而导致多种肿瘤的发生、侵袭与转移[1]。因此，claudins蛋白与肿瘤的相关性研究已成为近年来研究的热点。claudin-1 是claudins蛋白家族中最早被发现的，并且是肿瘤表达中最失调的claudins蛋白之一。已有研究证实claudin-1在神经系统、消化系统、内分泌系统及生殖系统肿瘤等中均存在异常表达，并且与肿瘤

的进展及预后密切相关，但其与皮肤肿瘤的相关性研究罕见报道。因此，本研究拟通过免疫组化法检测claudin-1蛋白在皮肤基底细胞癌（BCC）组织中的表达，从而初步探讨claudin-1在BCC发病机制中的作用，为BCC的早期诊断和基因靶向治疗建立实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 claudin-1兔抗人多克隆抗体（Abcam公司），免疫组化SP试剂盒、DAB显色试剂盒（南京凯基生物发展有限公司）。

1.1.2 样本资料 收集2014年11月—2016年11月于苏州市吴江区中医医院皮肤科就诊、其临床表现及组织病理确诊为BCC的38例患者，男20例，女18例，年龄50～77岁，平均年龄（63.8±8.0）岁，病程5个月～3年。正常对照组标本来源于手术切除时所带的正常皮肤组织。取材部位均为头面部，所有标本具有典型或较为典型的皮损，并且通过苏木精-伊红（HE）染色证实均具有典型的组织病理学改变。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化法检测组织样本中claudin-1蛋白的表达 将所有标本按常规方法进行石蜡包埋、切片，严格按照试剂盒步骤进行检测。①抗原修复：先将放有切片的耐高温塑料染色架放入盛有抗原修复液的烧杯中，高火档至煮沸，将烧杯取出置于电热器上保持微沸状态20 min，再将烧杯浸入流水中自然冷却后用PBS浸洗3次。②灭活酶：每张切片滴加2滴3%H2O2-甲醇溶液，室温封闭10 min。PBS浸洗3次。③封闭：滴加即用型山羊血清50～100 μl，室温孵育20 min。④抗原-抗体反应：滴加一抗（1：100稀释）50 ～ 100 μl，37 ℃，湿盒孵育 2 h，PBS 浸洗 3次。⑤加增强剂：滴加增强剂50 μl，室温湿盒孵育30 min。PBS浸洗3次。⑥一抗二抗反应：滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体50 μl，室温孵育30 min。PBS清洗3次。⑦显色、复染，最后脱水封片，光学显微镜下观察。

1.2.2 结果判定 高倍镜（×400）下选取10个视野，综合染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。染色强度评分标准：不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。阳性细胞所占比例评分标准：阳性表达细胞数＜5%为0分，5%～35%为1分，35%～65%为2分，＞65%者为3分。两者评分相乘，0～2分为阴性，3～9分均判断为阳性。

1.3 统计学方法

实验数据分析均通过SPSS13.0统计学分析软件进行。claudin-1在皮肤BCC和癌旁正常皮肤组织的免疫组化阳性率间的比较采用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 claudin-1蛋白在癌旁正常皮肤和BBC组织中表达情况（SP法）

2 结果

免疫组化检测结果显示，claudin-1蛋白在癌旁正常皮肤组织中呈强阳性表达，定位于表皮基底层至颗粒层的角质形成细胞膜上，呈棕褐色（图1a）；而在BCC中，其表达信号明显降低，呈弱阳性至阴性表达（图1b）。claudin-1蛋白在癌旁正常皮肤组织和BCC组织中的阳性表达率分别为100%（38/38）和21.05（8/38），两组比较，差异具有统计学意义（P＜ 0.05）。

3 讨论

claudin-1是紧密连接中最重要的骨架蛋白，在心脏、肝脏、脑组织、脾脏、肺部、肾脏等器官中均有表达。本研究发现claudin-1蛋白在正常皮肤组织中呈强阳性表达，阳性率可达100.00%，且主要定位于表皮基底层至颗粒层的角质形成细胞膜上，呈棕褐色、线状分布，该结果与翁立强等[2]研究结果基本一致。

大量研究证明，claudins蛋白在肿瘤中的表达具有组织特异性，且同一种claudin蛋白在不同肿瘤组织中的表达或者在同一类型肿瘤的不同病理亚型中的表达亦各不相同，这种表达的差异性为肿瘤的诊断、治疗均提供了新的思路。现已有研究发现claudin-1蛋白的表达情况及其作用在不同肿瘤或同一肿瘤的不同亚型或不同分期中所起到的作用不尽相同。如在浸润性乳腺癌中，claudin-1的表达低于正常上皮组织[3]，而在食管鳞癌中claudin-1的表达显著高于癌旁组织[4]。claudin-1在肺腺癌中表达下降，而在肺鳞癌中表达升高，故可作为鉴别肺鳞癌和肺腺癌的重要指标[5]。在甲状腺癌中，乳头状癌claudin-1呈高表达，而滤泡性癌和滤泡性腺癌呈低表达[6]。在口腔鳞状细胞癌中，claudin-1在癌旁口腔上皮组织、高分化鳞癌、中和低分化鳞癌中均有信号表达，表达水平呈下降趋势[7]。然而claudins蛋白与皮肤肿瘤中的相关性研究较少。最新一项研究发现，claudin-1在正常表皮和脂溢性角化病（SK）中的表达明显高于日光性角化病（AK）、鲍恩病和皮肤鳞状细胞癌（SCC），由此推测皮肤SCC的发生可能与claudin-1的表达下调（或缺失）导致细胞间黏附性丧失，细胞分化变差及侵袭性增加有关[2]。

BCC是一种常发生在表皮或皮肤附属器的恶性肿瘤，起源于上皮干细胞[8]，位居皮肤肿瘤发病率的第一位。有关claudin-1与BCC的相关性研究在国内极少。本研究通过分析38例BCC组织中claudin-1蛋白的表达情况，并运用统计学分析两者之间可能存在的作用关系。研究结果显示claudin-1蛋白在BCC中的表达明显低于癌旁正常皮肤组织，推测可能其在肿瘤的发生中也参与作用。

本研究虽然从组织病理学上证实claudin-1蛋白在BCC中呈现低表达， 但其具体的作用分子机制不详，应采用分子生物学技术进一步探讨。