Hartley豚鼠源链球菌的分离鉴定及防治措施

陈 峰 沈 振 杨国丽 党安坤 兰邹然

（①山东省动物疫病预防与控制中心 山东 济南 250022 ②山东省食品药品检验研究院 山东济南 ③辽宁省动物疫病预防控制中心 辽宁 沈阳）

豚鼠又被称为荷兰猪、天竺鼠等，属哺乳动物纲-啮齿目-豚鼠科-豚鼠属。Hartley豚鼠是人工驯化后的英国种豚鼠，因其短毛、白化等优点被实验室广泛使用。我国各实验、检测单位所使用的试验用豚鼠基本上以Hartley豚鼠为主[5]。豚鼠体型匀称，个头娇小，随着生物制品产业的快速发展和更加严格的产品质量检验要求，以及动物试验周期性、伦理性等方面的优点，使得hartley豚鼠的使用量逐年增多，豚鼠在生物医学研究中的使用量成为大鼠、小鼠、家兔之后，位居第四位的实验动物[3]。其中Hartley豚鼠作为实验动物中的重要一员，不仅是常规药品检验、生物制品检验、GLP(Good Laboratory Practice)实验室中相关试验所需要的，更是许多科研项目所必备的实验动物之一。

链球菌种类众多，在自然界分布极为广泛，有些是非致病菌，构成任何动物的正常菌群，有些可致人或动物的各种化脓性疾病、肺炎、乳腺炎、败血症等[7]。链球菌呈圆形或卵圆形，直径小于2.0µm，常排列成链状或成双，也有单个出现的，属于革兰氏阳性菌。致病性的链球菌对营养要求较高，普通培养基生长不良，加血液或血清的培养基生长良好。链球菌可以根据在血琼脂平板上的溶血现象分为α、β、γ三类，其中β型溶血链球菌致病力最强，常引起人及动物各种疾病[7]。马链球菌兽疫亚种(旧称兽疫链球菌)在自然界分布广泛，有家畜的地方皆有存在，在血平板是上产生明显的β溶血[7]。2017年4月，山东省济南市某豚鼠饲养场发生以呼吸系统为主要病症的疾病。通过对患病豚鼠病原采集、分离鉴定、毒力试验、药敏试验等，确定病原微生物为链球菌所致。通过对本病原菌进行分离鉴定及药敏试验，为临床的科学防治提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品 2017年4月，山东省济南市某豚鼠饲养场发生以呼吸系统为主要症状的疾病，并伴随咳嗽、气喘、脓性鼻涕直至死亡。疾病发生后，前往养殖场采集病死、濒死豚鼠样品10份。

1.2 实验动物与主要试剂 18～22gⅠCR小鼠，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。250g至300gHartley豚鼠购自济南金丰实验动物繁育有限公司。血琼脂培养基、胰蛋白胨营养琼脂培养基(TSA)购自北京陆桥。胶回收试剂盒、PCRmix、DS2000DNA Marker购自上海生工。药敏试纸、微生物鉴定所用GN细菌鉴定卡购自其生产商销售代理。

1.3 患病动物临床症状与诊断 通过问诊、视诊、触诊，记录临床症状。对患病死亡动物进行解剖检查，记录病变脏器症状。肺脏、肝脏、肾脏等脏器的无菌切面直接触片，用瑞氏染色后镜检。

1.4 细菌的分离纯化培养 用无菌接种环穿破脏器表面沾取组织后，在血琼脂培养基平皿上划线。经过恒温水浴箱37℃、24h培养。对菌落进行观察，把菌落形态特征相近类似的进行划线培养。反复多次。选取单个菌落接种血琼脂培养基划线培养。

1.5 细菌的生化特性检查 应用VETEK 2 compact全自动微生物分析仪，使用GN细菌鉴定卡检测。

1.6 16SrRNA基因序列测定与分析 以分离纯化后的菌液为DNA模板，选取16srdna基因扩增引物(7F1540R：5"-CAGAGTTTGATCCTGGCTAGGA GGTGATCCAGCCGCA-3"，27F1492R：5"-AGTT TGATCMTGGCTCAGGGTTACCTTGTTACGAC TT-3"，PCR长度1500bp左右)进行PCR扩增。PCR循环条件：94℃4min，94℃45sec、55℃ 45sec、72℃1min、30cycle，72℃10min。回收pcr产物，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，利用blast进行同源性比对，采用mega7的neighbor-joining(NJ)法构建系统进化树[1]。

1.7 药敏试验 采用kirby-bauer琼脂扩散法，通过测量抑菌圈的直径，重复3次，取平均值。依据CLSⅠ的抗菌药物敏感性试验标准，判定分离菌株对药物的敏感性。

1.8 分离菌毒力试验 首先配置菌液，前一天接种TSA培养基后，37℃培养24h。用移液管吸取5ml生理盐水放入培养基中，用无菌接种环剥落培养基上的菌落，制备成菌悬液移入无菌试管中，菌液浓度调制3个10倍梯度(6.34×107CUF/ml，6.34×106CUF/ml，6.34×105CUF/ml)，调制后密封管口备用。选取20只18g-20gⅠcr小鼠和5只280g-320g豚鼠。Ⅰcr小鼠分为4组，每组各5只动物。其中1～3组每组对应一个菌液浓度分别给药，每只ⅠCR小鼠注射0.2ml菌液。第4组每只icr小鼠注射0.2ml生理盐水。豚鼠分为2组，其中3只豚鼠腹腔注射浓度为6.34×106CUF/ml的0.5ml菌液，另外2只豚鼠腹腔注射0.5ml生理盐水。

2 结果

2.1 临床症状 精神沉郁，食欲下降，饮水减少，有的则食欲废绝无饮水，体型消瘦，毛焦，弓身蜷缩，腹式呼吸，鼻头潮红有粘液，有的为黄色脓状物，少数豚鼠颈部肿大。濒死及死亡动物常口鼻出血。

2.2 剖检症状 剪开腹腔有严重的腹腔出血，肝脏有绿豆大小梗死灶，肾脏色白，肺脏大面积实质性肉变，心脏多处有针尖样出血，颌下淋巴结淤血肿胀，淋巴结断面呈红白相间大理石样，气管有淤血和粘稠状物。

2.3 涂片镜检 用瑞氏染色后镜检发现，有呈卵圆形，无两级着色，大部分呈单个存在，少量呈锻炼状结构的球菌。

2.4 细菌的分离培养 观察发现血平皿长出透明点状菌落，菌落边缘光滑，有凸起，色泽呈黄白色。菌落周围出现完全溶血的β溶血环(见图1～2)。

图1 分离菌株

图2 分离菌株呈β溶血环

2.5 分离菌的生化特性鉴定 应用VETEK 2 compact全自动微生物分析仪，使用GN细菌鉴定卡检测。得到的实验数据报告显示与猪链球菌Ⅰ型(Streptococcus suis Ⅰ)有93%几率相似。相似几率不是很高，这有可能是细菌鉴定卡数据库不全面导致的。但通过生化特征指标可以判定该分离菌为链球菌。这与分离培养时出现的β溶血环等特征相符。 检测结果见表1。

表1 分离株的生理生化特征

2.6 分离菌16SrRNA基因序列测定与分析 将分离菌株16SrRNA PCR产物进行测序和分析，发现所获取的DNA片段长度为1507bp。分离菌株与马链球菌兽疫亚种(CP002904.1)高达99%的同源性。将该菌基因序列在BLAST进行同源性比对，利用MEGA7构建系统进化树可知，该分离菌与马链球菌兽疫亚种CP002904.1、FM204884.1、CP021972.1、FM204883.1株的遗传关系最为接近，处于同一分支上。结合分离菌株生化特征，则判定分离菌株为马链球菌兽疫亚种，并将其命名为sd2017fc。进化树情况见图3。

2.7 分离菌药敏试验 药敏试验选取了临床常用抗生素，作为测试对象。选取的抗生素有：头孢曲松钠、青霉素、阿莫西林、头孢呋辛钠、哌拉西林、氨苄青霉素、阿奇霉素、环丙沙星、甲氧苄啶、头孢噻肟、磺胺甲基异唑、庆大霉素。结果显示，分离菌株对头孢曲松钠、青霉素、阿莫西林、氨苄青霉素、哌拉西林环丙沙星等最为敏感。对阿奇霉素、庆大霉素有一定的耐药性。

2.8 分离菌毒力试验 小鼠毒力试验按照三种菌液浓度分别对应注射，并在给药后的3、5、8、24、36、48h时间点给与观察。观察发现6.34×107CUF/ml组在注射菌液后小鼠未表现明显症状就出现死亡，并在8h观察时发现小鼠全部死亡。6.34×106CUF/ml组注射后5h观察发现有2只小鼠出现呼吸困难等症状，在24h观察时发现仅存的两只小鼠也出现了呼吸困难的症状，并在48h观察发现小鼠全部死亡。6.34×105CUF/ml组在5h观察时发现有1只小鼠出现呼吸困难症状，在24h观察时发现死亡两只小鼠，1只小鼠存在呼吸困难，在48h观察时仅有1只小鼠存活，但已出现呼吸困难处于濒死状态。生理盐水组未发现异常症状和死亡(见表2)。豚鼠毒力试验按照6.34×106CUF/ml菌液浓度注射3只豚鼠，另外两只注射生理盐水。注射菌液的3只豚鼠均出现流涕、咳嗽等症状，24h观察时全部死亡。注射生理盐水的两只豚鼠未出现明显症状，未死亡。对死亡的小鼠和豚鼠进行解刨，并在肺脏再次分离到细菌，通过镜检和生化特性鉴定与注射菌液为同一种细菌。

表2 分离菌小鼠毒力试验(给药后存活数) (只)

3 讨论

（1）结合临床症状以及利用培养基分离细菌进行菌落形态观察，可以初步判断致病细菌种类。对于临床的及时诊疗有很重要的参考意义。利用VETEK2compact全自动微生物分析仪，可以快速的找出最为相似的细菌进行判定，但本次鉴定中受到细菌数据库种类和系统授权等原因，只能找到数据库中最为相似的细菌进行判定，导出结果具有局限性。但是其生化特性指标是重要的参照依据，可以通过这些指标进一步查询和判定。依据基因数据库的优势，是判定分离菌株为何种细菌最为准确有效的方式，但周期较长，判定速度相对较慢。通过毒力试验，分离菌株菌液注射小鼠和豚鼠后均引起了临床症状和死亡，通过再次分离得到的细菌与注射的分离菌株相同，验证了其分离菌株毒力，也证明了分离菌株就是该病致病菌。结合药敏试验，在药物选择上，药敏试验结果与钟英梅等[6]所报道的对阿莫西林、环丙沙星、氨苄青霉素敏感，而对庆大霉素等敏感度较低等内容相似。最终选择阿莫西林进行治疗，死亡量明显下降，疫病得到了有效控制。（2）链球菌是人畜共患菌，对动物和人均有致病性。本次通过患病豚鼠分离得到的马链球菌兽疫亚种细菌，这与唐海波等[1]报道的在黑豚鼠身上分离得到的链球菌为一类，但临床症状上未发现眼睛发白甚至失明等有区别。患病豚鼠体型消瘦，毛焦，弓身蜷缩，常有口鼻出血的症状这些与张钰等[8]、付少才等[9]报道的非常相似，但只有少量患病动物表现颌下淋巴结肿大与其报道不同。也有可能是急性病例未能产生颌下淋巴结肿胀症状只表现出其他症状后就死亡的原因，所以本次病例中少见脖子肿大症状。综上所述豚鼠由链球菌引起的肺炎，多以精神沉郁、鼻腔脓性分必物、颌下淋巴结肿胀、急性者多口鼻出血为主要临床症状。（3）Hartley豚鼠引起生理学特点，对于环境要求较高。对日温差等条件的要求较为苛刻。尤其是春季和秋季，冷热交替现象较多，易导致豚鼠机体产生应激反应，导致免疫力降低，从而感染链球菌导致患病[4]。从这点上出发，应从内、外两方面来考虑解决问题。一方面是外部环境给予充分支撑，保障其饲养生产环境可靠，饲养用具消毒清洁要做到位等[2]。另一方面，可以从提升其自身免疫力入手，例因其不能自身合成维生素C，所以在饲养过程中应多关注豚鼠维生素C的摄取量，保障其日常所需[10]。使得动物机体有一定的抵抗力，不易致病。