枣瘿蚊微卫星标记筛选及微卫星多态性分析

马光皇 ,康淑媛 ,李 莉 ,肖海兵,3 ,熊仁次 ,杨明禄,3

(1.塔里木大学植物科学学院，新疆阿拉尔 843300；2.南疆农业有害生物综合治理兵团重点实验室，新疆阿拉尔 843300；3.农业部阿拉尔作物有害生物科学观测实验站，新疆阿拉尔 843300)

0 引 言

【研究意义】枣瘿蚊 (DasineurajujubifoliaJiao & Bu，2016)，属双翅目(Diptera)瘿蚊科(Cecidomyiidae)枣瘿蚊[1]。别称枣芽蛆、枣叶瘿蚊，主要寄主有红枣树和酸枣树。该虫分布范围较广，在新疆、山东、浙江、陕西等各地枣产区均有出现[2-4]。研究种群遗传结构分析害虫的扩散途径、抗性标记等，对其研究害虫成灾机制和综合防控技术有重要意义。【前人研究进展】枣瘿蚊每年发生3～6代，其中发生最多和危害最严重的是第1代和第2代[5]。枣瘿蚊体态较小，虫体长1～2 mm，体色橙红红或灰褐，念珠状触角，黑色复眼；卵长椭圆形，长0.2 mm左右，近似透明，刚生产时卵为白色，后逐渐变为红色，且有光泽；幼虫似蛆，有3个龄期；蛹黄褐色，长1～2 mm；茧为椭圆形，灰黄色，长1～2 mm[6]。枣瘿蚊越冬由最后一代老熟幼虫在浅土层化茧完成，越冬成虫于4月开始危害枣树嫩叶，使叶片从叶边缘开始卷曲且呈筒状，叶片从绿色变为红色，后期变为黑色并脱落[7]。枣瘿蚊常危害主枝顶芽，在受灾严重区域，枣树被害率高达100%，严重影响枣的产量和品质[8]。目前，针对枣瘿蚊防治多为化学方法[9-11]，以黄板诱杀作为辅助性措施，以减少枣园被危害程度。目前随着微卫星标记应用的逐渐成熟与完善，利用微卫星标记研究种群遗传已成为常态。种群遗传结构研究方法包含随机扩增多态性DAN、扩增片段长度多态性和微卫星标记等，其中微卫星(Microsatellties)因重复性好、使用方便而备受推崇。微卫星又称简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR),序列的重复数是高度的，在基因组中通常以1～6个短核苷酸串联的形式出现，组合成几十个到上百个核苷酸的重复序列[12-13]，微卫星较基因组DNA中的其他区域具有更高的突变率，且微卫星序列相邻的两侧区域保守性较高，通过PCR技术和凝胶电泳检测技术可方便检测其位点多态性[14]。因微卫星在个体或种群之间都具有较强的多态性，广泛应用于生物遗传多样性和基因定位等研究中[15-16]。【本研究切入点】枣瘿蚊的微卫星研究未见报道。研究枣瘿蚊基因遗传变异程度，分析基因多态性。【拟解决的关键问题】枣瘿蚊基因组数据库搜索SSR，来设计SSR引物进行多态性筛选。为枣瘿蚊种群遗传结构研究等提供支持。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品

在阿拉尔市(塔里木大学周边)、昆玉市(79°18′39.871″，37°14′45.800″)、且末县(85°30′19.298″,38°13′43.780″)，每地分散采集有幼虫枣叶，用于基因组DNA提取。

1.1.2 试剂及仪器

通用型柱式基因组提取试剂盒、Taq酶和DM2000 maker(康为世纪)；无水乙醇(天津致远化学试剂有限公司)、琼脂糖(BIOWEST)等。

基因扩增仪(BSW-6T-II上海启步生物科技有限公司)；紫外凝胶成像仪(Gel Doc XR+ 上海旦鼎国际贸易有限公司)；高速离心机(PICO21 Thermo Fisher)；高通量组织研磨器(SCIENTZ-48宁波新芝生物科技股份有限公司)；电泳仪(DYCP-32B北京六一生物科技有限公司)；电热恒温水浴锅(DK-80上海精宏实验设备有限公司)等。

1.2 方 法

1.2.1 枣瘿蚊DNA提取及质量检测

按照通用型柱式基因组提取试剂盒提取枣瘿蚊DNA，于1%琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测，以微量核酸检测仪检测DNA浓度与OD260/280比值。

1.2.2 微卫星引物设计

以枣瘿蚊基因组DNA为模板，分别对所随机选取的48对微卫星引物进行PCR扩增，以MISA检测枣瘿蚊特定基因组序列中的SSR[17]，参数设置为SSR最小间距为200 bp，1～6核苷酸最少重复次数分别为10、6、5、5、5、5。以Primer3设计SSR上下游引物，从中挑选出48对引物交由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2.3 PCR反应体系

20 μL反应体系：10×PCR buffer 2 μL；dNTP 0.4 μL；Taqpolymerase 0.1 μL；DNA1 μL；F引物0.8 μL、R引物0.8 μL；ddH2O 14.9 μL。

1.2.4 PCR反应条件

94℃预变性3 min；94℃变性30s，退火50℃(或54或58℃)30s，延伸72℃ 20s，进行34个循环；终延伸72℃ 5 min，4℃保存。

1.2.5 PCR产物凝胶检测

用2%琼脂糖凝胶进行PCR产物电泳检测，初步筛选出稳定扩增的引物。

1.2.6 微卫星多态性检测

按Fragment Analyzer及其试剂盒要求进行毛细管电泳检测，PROSize2.0片段分析软件分析电泳结果，人工校对后将PCR产物长度记录于Excel表中。

1.3 数据处理

利用Excel软件整理电泳数据，并转换成Cervus(3.0)软件输入的文本格式，由Cervus计算微卫星的等位基因数(Na)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)等。

2 结果与分析

2.1 核酸检测

研究表明,阿拉尔市、昆玉市和且末县样品各20只，提取枣瘿蚊DNA，凝胶电泳检测发现条带单一且明亮，无拖尾。枣瘿蚊基因组DNA的OD260/280值均在1.4～2.0，DNA浓度在20～40 ng/μL。图1

注：第1泳道至第4泳道分别对应昆玉市1～4号枣瘿蚊样品
Note:Lanes 1 to 4 correspond to samples ofDasineurajujubifoliain Kun Yu City 1-4 respectively

图1 昆玉市部分枣瘿蚊样品基因组DNA提取琼脂糖电泳
Fig.1 Genomic DNA extraction and agarose electrophoresis ofDasineurajujubifoliasamples in Kun Yu

2.2 PCR引物筛选

以枣瘿蚊基因组DNA为模板，分别对所随机选取的48对微卫星引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测发现42对能扩增出条带，剔除扩增片段大小与预测不一致和扩增不理想的引物，发现有20对引物能稳定、清晰的扩增出条带，可进行后续SSR多态性筛选。表1,图2

表1 筛选的枣瘿蚊20对SSR引物信息Table 1 Information of 20 pairs of SSR primer from Dasineura jujubifolia

注：使用阿拉尔1号DNA,1～24泳道分别对应Dj01～Dj24号引物电泳结果
Note:Using Alar No.1 DNA,lanes 1-24 correspond to the results of the electrophoresis of the Dj01-Dj24 primer

图2 枣瘿蚊部分SSR引物PCR琼脂糖电泳
Fig.2 The part result of PCR agarose electrophoresis ofDasineurajujubifolia

2.3 微卫星多态性

研究表明,扩增产物经毛细管电泳检测发现条带清晰，片段长度在预测范围内，经人工比对后将检测到片段大小数据导入Excel。经Cervus软件计算20个微卫星位点共扩增出112个等位基因，平均每个位点扩增出5.6个等位基因，等位基因数(Na)在3～9，其中Dj-33扩增出9个等位基因；微卫星位点的观测杂合度(Ho)在0.120～0.680，期望杂合度(He)在0.549～0.847，多态信息含量(PIC)在0.456～0.815；处理得其中Ho、He、PIC平均值分别是0.358、0.694和0.635；其中PIC值小于0.50的有Dj-13、Dj-20；其他特异性引物PIC值也大于0.50，引物多态性较高，可用于枣瘿蚊的遗传多样性或种群遗传结构等方面的研究。图3,表2

表2 引物在枣瘿蚊个体的多态性验证Table 2 Verification of the Polymorphism of the Primers in Dasineura jujubifolia

注：使用若羌5号DNA,A1～A11分别对应Dj01～Dj11号引物毛细管电泳结果
Note:Using Ruo Qiang No.5 DNA,A1-A11 correspond to Dj01-Dj11 primer capillary electrophoresis results

图3 若羌Dj01～Dj11引物在个体毛细管电泳结果
Fig.3 The result of Ruoqiang Dj01-Dj11 primer in capillary electrophoresis

3 讨 论

微卫星在生物个体间呈现高度变异性，在基因组中基因型丰富，因此,微卫星标记广泛应用于系统发育、遗传结构和遗传多样性研究领域[18]。近年来，已有研究者利用微卫星标记来达到研究种群遗传结构的目的，但是枣瘿蚊的种群遗传结构研究较少，枣瘿蚊微卫星标记开发为其种群遗传结构等研究提供了支持。

多态信息含量(PIC)是衡量微卫星位点群体多态性的重要指标之一,可以反映出群体的遗传变异程度[19]，一般认为：当PIC>0.50时，代表位点具有高度多态性，当0.25

但研究采样存在覆盖范围较小的局限，对枣瘿蚊种群遗传多样性分析也是探索性的，今后应对全疆乃至全国进行采样，研究枣瘿蚊快速扩散后的种群遗传多样性与遗传结构特征。

4 结 论

开发了枣瘿蚊微卫星标记，筛选出20个微卫星位点，其观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)平均值分别是0.358、0.649和0.635，其中得到18个理想的微卫星位点，其PIC值>0.5，具有较高的多态性，可用于枣瘿蚊种群遗传多样性及遗传结构研究。