蛙皮素样肽家族及其受体氨基酸序列信息学比较分析

赵树林，李璐璐，孙小燕，阿迪莱·艾力，赵红琼

(新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】蛙皮素(Bombesin)最早分离于Bombina蛙皮肤，是一种由14个氨基酸组成的多肽，具有促进胃液分泌的作用[1,2]。将与蛙皮素C-端氨基酸具有同源性的多肽称为蛙皮样肽(Bombesin-like peptide, BLP)，BLP家族根据其C-端氨基酸的同源性分为蛙皮素、牛蛙肽(Ranatensin)和叶泡雨滨蛙肽(Phyllolitorin)3个亚家族[3]，其氨基酸序列比对见图1，且所有多肽C-端甲硫氨酸被氨基化(-NH2)。【前人研究进展】蛙皮素亚家族包括蛙皮素、产婆肽(Alytesin)和胃泌素释放肽(Gastrin-releasing peptide, GRP)。GRP分离于哺乳动物，为27或29个氨基酸序列，具有促进胃泌素分泌的作用，且在哺乳动物还发现了同GRP的C-端10个氨基酸序列完全相同的神经介素C(Neuromedin C, NMC)。牛蛙肽亚家族包括牛蛙肽和分离于哺乳动物的神经介素B(Neuromedin B, NMB)等[4]。NMB具有促进大鼠平滑肌收缩等作用[5]。【本研究切入点】目前，在哺乳动物发现的BLP家族多肽仅有GRP和NMB，用分别通过GRP受体(GRP-R)和NMB受体(NMB-R)起作用[6]，并且2种受体均为7次跨膜(7-Transmembrane, 7-TM)受体[7]。由于动物不同，BLP家族多肽或受体氨基酸序列不同，在进行不同动物BLP家族多肽功能研究或其相应抗体制备过程中，需要关注目的动物BLP氨基酸序列的特异性及其同源性，并进行氨基酸信息学分析比较。针对BLP家族氨基酸信息学分析的文献仅见Graham团队对21种动物进行了比较[8]，但其主要对BLP家族全肽(例如：PreproGRP)进行分析，而未关注最终起作用的成熟肽，特别是反刍动物BLP序列与其他动物的不同。【拟解决的关键问题】研究比较GRP和NMB 2种多肽激素及其受体的氨基酸序列在不同动物物种间的差异性，特别是牛等反刍动物同其他动物之间的序列差异，并进行生物信息学分析，为在反刍动物进行BLP家族多肽结构和功能研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)分别用“GRP”和“NMB”为关键词检索GRP和NMB及其受体的氨基酸序列，当检索到同一个物种多个信息数据的时候，标记了“Reviewed(引用)”是首先选择参考的信息数据。再用“Align(排列)”功能进行牛GRP和NMB多肽或受体蛋白氨基酸序列与其他动物序列差异进行比较。同时，比对了牛GRP-R与NMB-R氨基酸序列，并标明各自7次跨膜区域。

1.2 方 法

用1.1筛选出的不同动物GRP和NMB及它们各自受体全氨基酸序列，通过DNAstar的Megalign 7.1构建GRP和NMB已有全部多肽及受体蛋白氨基酸序列进化树。

2 结果与分析

2.1 蛙皮素样肽家族氨基酸序列对比

研究表明,蛙皮素、牛蛙肽和叶泡雨滨蛙肽3个亚家族的不同多肽的氨基酸序列对比，彩色低纹表示高度保守的氨基酸序列，其中C-端甲硫氨酸均被氨基化(-NH2)。图1

2.2 不同动物GRP氨基酸序列比对

牛(Bovine, UniProt 登录号Q863C3，下同)27个氨基酸序列的GRP同其它12种不同动物成熟的GRP比对结果见图2，这12种动物为绵羊(Sheep, P47851)、人(Human, P07492)、猪(Pig, P63153)、豚鼠(Guinea pig, P63152)、狗(Dog, P08989)、虹鳟鱼(Rainbow Trout, Q9PS30)、金鱼(Goldfish, Q9I8Z9)、马(Horse, F7DYM4)、小鼠(Mouse, Q8R1I2)、大鼠(Rat, P24393)、鸡(Chicken, P01295)、美洲短吻鳄(American alligator, P31886)，其中仅马和金鱼的GRP序列在UniProt中标记为“Unreviewed”，其它均为“Reviewed”。由氨基酸序列比对可知，所列13种动物C-端8个氨基酸序列完全相同，牛、羊、人、猪、豚鼠、狗、虹鳟鱼、金鱼和马C-端的10个氨基酸序列(GRP10-27, 即NMC)完全相同，而小鼠、大鼠、鸡和美洲短吻鳄C-端10个氨基酸(NMC)完全相同。牛和绵羊的27个氨基酸仅在C-端20位氨基酸不同(分别为甘氨酸和丙氨酸残基)，其他均相同。图2

注：灰色底纹表示高度保守的氨基酸残基
Note: Amino acids with gray background showed highly conserved residues

图1 蛙皮素样肽家族氨基酸序列对比
Fig.1 Comparison of amino acid sequence among bombesin- like peptide family

在UniProt中用“BLAST”比较牛GRP氨基酸序列(Q863C3, 134个氨基酸)与其他动物已有的全部序列相似性。牛GRP氨基酸序列与绵羊的最接近，为88.7%；其次为猪和豚鼠，两者相同为77.8%；与狗、鲟鳟鱼、马、美洲短吻鳄、人、小鼠、大鼠、鸡的相似性分别为74.1%、73.7%、72.7%、67.9%、63.7%、63.2%、63.2%、63.0%。用“Megalign”构建进化树分析GRP已有的全部氨基酸序列显示，小鼠与大鼠、豚鼠与马、牛与绵羊、人与狗分别在同一个分支上，而美洲短吻鳄、鸡、虹鳟鱼和金鱼与哺乳类相距较远。图3

2.3 不同动物NMB氨基酸序列比对

研究表明,牛(Bovine, Q2T9U8)、人(Human, P08949)、小鼠(Mouse, Q9CR53)、猪(Pig, P01297)、马(Horse, F7E042)、狗(Dog, J9NU40)、绿猴(Green monkey, A0A0D9RXD7)、恒河猴(Rehsus macaque, H9EYU4)、金仓鼠(Golden hamster, A0A1U7R215)、扬子鳄(Chinese alligator, A0A1U7RLL3)等10种动物成熟的32个氨基酸序列NMB比对情况。牛、人、小鼠和猪GRP在“UniProt”标记为“Reviewed”，其它为“Unreviewed”。NMB氨基酸序列比对结果可知，所列动物C-端10个氨基酸完全相同，而不同区域主要集中在N-端；同时，小鼠与金仓鼠、绿猴与恒河猴NMB的32个氨基酸序列完全一样。图4

注：灰色底纹氨基酸残基表示与牛GRP氨基酸序列比对不同的氨基酸残基
Note: The amino acids with gray background showed differences compared to bovine GRP

图2 不同动物GRP氨基酸序列比较
Fig.2 Comparison of GRP amino acid sequences in different animals

图3 不同动物GRP氨基酸已有全部序列进化树
Fig.3 Evolution tree of GRP amino acid showed all sequences in different animals

注：灰色背景氨基酸表示与牛NMB氨基酸序列比对不同的氨基酸
Note: The amino acids with gray background show differences compared to bovine NMB

图4 不同动物32个氨基酸序列的NMB比较
Fig.4 Comparison of 32-amino acid sequence in NMB from different animals

2.4 不同动物GRP-R和NMB-R氨基酸序列比较

用“Megalign”构建GRP-R全氨基酸序列进化树，包括牛(Bovine, E1BL07)、人(Human, P30550)、小鼠(Mouse, P21729)、大鼠(Rat, P52500)、狗(Dog, E2QTA7)、猪(Pig, K7GR81)、鸡(Chicken, Q802E7)、马(Horse, F7CVR9)、鸭嘴兽(Duck-billed platypus, F7FDW9)、金仓鼠(Golden hamster, A0A1U7QVZ5)、斑马鱼(Brachydanio rerio, E7F6G4)、美洲短吻鳄(American alligator, A0A151NOH2)。在UniProt数据库仅人(Human, P30550)、小鼠(Mouse, P21729)、大鼠(Rat, P52500)标记为“Reviewed”，其他动物标记为“Unreviewed”。进化树分析显示，猪与马、牛与狗、大鼠与小鼠、鸡与美洲短吻鳄分别在同一分支上，而斑马鱼和鸭嘴兽同其它动物相距较远。“BLAST”分析显示，与牛GRP-R的氨基酸序列比较相似性最高的为狗(96.1%)，接下来依次为马、猪、人、金仓鼠、大鼠、小鼠、鸭嘴兽、鸡、美洲短吻鳄和斑马鱼，相似性分别为94.3%、94.0%、93.0%、90.9%、90.3%、89.4%、83.9%、82.4%、81.4%和74.9%。图5

图5 不同动物GRP-R已有全部氨基酸序列进化树
Fig.5 Evolution tree of GRP-R amino acid showed all sequences in different animals

研究表明,NMB-R氨基酸序列进化树，包括牛(Bovine, E1BMN4)、人(Human, P28336)、大鼠(Rat, P24053)、小鼠(Mouse, O54799)、猪(Pig, B2ZI34)、马(Horse, F6VCY9)、狗(Dog, E2R9E7)、鸡(Chicken, E1BRP1)、鸭嘴兽(Duck-billed platypus, F6Y0D2)和热带爪蟾(Western clawed frog, F6PHZ7)。在UniProt数据库中标记为“Reviewed”仅有人、小鼠、大鼠。进化树分析显示，牛与猪、小鼠与大鼠分别在同一个分支上，鸡、鸭嘴兽和热带爪蟾与其它哺乳动物相距较远。“BLAST”分析显示，对于牛NMB-R的已有氨基酸序列，相似性最高的为猪，达92.3%；其次为人和马，分别为91.5%和91.0%；狗、小鼠、大鼠、鸭嘴兽、热带爪蟾、鸡相似性分别为89.2%、89.0%、88.2%、81.0%，76.3%、72.8%。图6

图6 不同动物NMB-R已有全部氨基酸序列进化树
Fig.6 Evolution tree of NMB-R amino acid showed all sequences in different animals

从UniProt数据库检索发现牛GRP-R(E1BL07)和NMB-R(E1BMN4)氨基酸序列长度分别为384和390个，相似性为62.2%。从两2个受体氨基酸序列比较可知，GRP-R和NMB-R的N-端胞外域分别为1～38和1～48位，C-端胞浆域分别为326～384和328～390位；2种受体7个疏水的跨膜片段氨基酸位置比较相近，但序列有所差异。图7

注：灰色底纹氨基酸为跨膜区域
Note：Amino acid with gray background means the TM region

图7 牛GRP-R和NMB-R氨基酸序列比较
Fig.7 Amino acid sequences of the bovine GRP-R and NMB-R

3 讨 论

研究通过对不同动物BLP家族2种多肽GRP和NMB氨基酸序列进行比较，结果显示不同动物成熟的GRP和NMB在C-端具有高度保守性，而在N-端区域变化较大，提示C-端是GRP和NMB的生物活性部位。Zhao等[9]报道，给犊牛注射27个氨基酸的牛GRP和10个氨基酸的NMC(为牛GRP的C-端10个氨基酸的多肽)均可显著升高血浆生长激素水平，验证了GRP的生物活性部位在C-端；然而注射NMB却不能改变犊牛血浆生长激素水平，提示GRP和NMB具有不同的生理功能。目前，公认为GRP与GRP-R亲和力高，而NMB与NMB-R亲和力高[10]。在大鼠大脑中主要是NMB亲和性受体，很少一部分中枢神经系统是GRP亲和性受体[11]，在食道平滑肌中存在NMB亲和性受体[12，13]，而在胰腺细胞中则是GRP和蛙皮素亲和性受体而非NMB亲和性受体[14]，提示GRP-R和NMB-R在机体组织定位不同，也反映出他们具有不同的生理功能。

从氨基酸序列分析不同动物GRP或NMB C-端具有高度保守性，例如，反刍动物(牛和羊)与人和鼠的GRP在C-端10个或8个多肽氨基酸序列完全相同。现在市面上销售的GRP产品主要为人和鼠多肽，因而在进行反刍动物GRP多肽功能研究时，可以选择人和鼠的GRP多肽用于反刍动物的研究。生物信息学研究表明，不同动物GRP-R和NMB-R氨基酸序列也具有高度保守性但不完全相同，在哺乳动物之间达90.0%，哺乳动物与鸟类为80.0%，可以预测不同动物的GRP或NMB可以交叉使用，但是可能会影响其同相应受体的亲和力，进而影响其生物学效率。

GRP-R和NMB-R 2种受体均属于G蛋白偶联7-TM受体[7]，在科学研究中需要制备目的动物7-TM受体的抗体时，在设计抗原或半抗原片段时选择受体膜外区域(非跨膜区域和胞内区域)制备的抗体与受体蛋白发生结合的可能性大，但是需要检索所选多肽片段同目的动物体内其他蛋白的氨基酸序列相似性，以免制备出的抗体特异性低。研究显示，牛GRP-R和NMB-R 2种受体相似性仅为62.2%，一方面解释了它们同内源性配体(GRP和NMB)亲和力不同的原因，另一方面，提醒在设计同一目的动物这2种受体的抗原时，要注意其抗原片段相似性。只有2种受体的抗原片段相似性低，制备出的抗体才能特异性地区别这两种受体。

4 结 论

采用生物信息学分析的方法比较了不同动物(特别是反刍动物牛)BLP家族GRP和NMB及其受体的氨基酸序列的差异性，GRP或NMB多肽C-端氨基酸序列在不同动物之间具有高度的保守性，而其特异性受体(GRP-R或NMB-R)氨基酸序列在哺乳动物之间相似性高达90.0%以上，但牛源这2种受体之间氨基酸序列相似性仅为62.2%，提示其与内源性配体亲和性不同。