不同动物粪源葡萄球菌耐药性调查及耐药基因检测分析

杨紫嫣，姚晓慧，马木尔·阿克木汉，王舒丰，王 凯，夏利宁

(新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】葡萄球菌(Staphylococcus)是革兰氏阳性菌，形态呈球形或稍椭圆形，因成葡萄串状，故名。其无鞭毛，无芽胞，多数为非致病菌，少数可致病。含有50多个种及亚种，在自然界中分布广泛，同时存在于人和动物的皮肤表面以及其鼻、咽和肠道中。葡萄球菌属于条件性致病菌，是最常见的化脓性球菌，可引起动物的乳房炎，关节炎以及葡萄球菌败血症等疾病[1]，给养殖业造成较大损失。【前人研究进展】已有报道表明，在养殖场周围的环境和空气中含有许多不同种的葡萄球菌，如：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌、松鼠葡萄球菌和科氏葡萄球菌等，其中金黄色葡萄球菌致病力最强且含量最多，占葡萄球菌属的24%左右，表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌含量次之，且致病力也较低[1]。葡萄球菌可引起多种感染，但引起的呼吸系统疾病占首位(65%)，葡萄球菌是上呼吸道感染的主要病原菌[2]，在动物临床上，可引起患病动物渗出性皮炎，导致动物生长发育缓慢，严重的葡萄球菌感染可引起仔畜死亡，并在畜群中广泛传播，引起巨大危害及经济损失[3]。【本研究切入点】为了提高治疗效果或达到预防疾病发生的效果，抗菌药物广泛且大量的用于临床，造成耐药菌株的数量急速上升[4]，导致通常有效的抗菌药物失去作用，给临床治疗带来极大的困难[5]。耐药葡萄球菌在影响家畜健康的同时也造成环境的污染，也可通过食物链将耐药性传播给人类，对人类的健康构成威胁[6]。【拟解决的关键问题】新疆霍城县作为新疆伊犁地区重要的畜牧养殖基地，然而有关霍城县不同动物源葡萄球菌耐药情况未见报道，耐药现状不明，在新疆霍城县主要规模化养殖场，对不同动物粪源葡萄球菌进行临床常用抗菌药物的耐药调查及相关耐药基因检测，获取的相应数据，指导临床合理用药，为新疆霍城地区葡萄球菌耐药数据库的建设提供有效依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

2016年10月在新疆霍城县不同规模化养殖场进行样品采集。采集猪粪源(长白)100份、羊粪源(阿勒泰)200份、牛粪源(褐牛)198份以及禽粪源(黑羽)300份，共计798份。以金黄色葡萄球菌ATCC29213作为标准质控菌(杭州天和微生物试剂有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 葡萄球菌分离鉴定

从采集的样品中吸取10 μL置于灭菌的含7.5%氯化钠营养肉汤中，经37℃恒温摇床增菌6～8 h后，用接种环蘸取一环增菌菌液在加有亚碲酸盐卵黄增菌液的Baird-Parker琼脂平板上划线接种，倒置于37℃恒温培养箱中培养24～48 h。葡萄球菌在Baird-Parker琼脂平板上为灰黑色至黑色有光泽圆形菌落，表面光滑湿润，挑取可疑单个菌落于1 mL营养肉汤中吹打混匀并增菌后保存备用。对疑似菌株进行革兰氏染色，选取镜检为紫色且呈葡萄串状排列，无芽孢、无荚膜的菌株，保存备用。同时进行触酶试验，挑取已培养18～24 h菌落于玻片上，滴加3%过氧化氢，立即出现气泡的菌株即为触酶试验阳性。确定为葡萄球菌的菌株保菌于60%的甘油肉汤中，-20℃保存并进行后续试验。

1.2.2 抗菌药物与培养基

试验共选用β-内酰胺类、喹诺酮类、酰胺醇类、氨基糖苷类、林可胺类、四环素类和福霉素类7大类10种抗菌药物进行药物敏感性试验。

抗菌药物：阿莫西林/克拉维酸(Amoxicillin/Clavulanic Acid，A/C)、头孢噻呋(Ceftiofur，EFT)、苯唑西林(Benzene，OX)；氧氟沙星(Levo-floxacin，DF)；氟苯尼考(Florfenicol，FFC)；阿米卡星(Amikacin，AMK)、庆大霉素(Gentamicin，GEN)；克林霉素(Clindamycin，CM)；四环素(Tetracycline，TE)和利福平(Rifampicin，RP)。(购自中国兽药监察所)。

培养基：MH肉汤(Mueller-Hinton Broth)，琼脂粉培养基(均购自北京奥博星生物技术有限公司)；BP(Baird-Parker)琼脂平板基础，亚碲酸盐卵黄增菌液(均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司)；氯化钠(购自天津市光复科技发展有限公司)。

1.2.3 药物敏感性试验

试验采用欧盟药敏试验标准委员会(EUCAST)[7]推荐的琼脂稀释法操作程序，检测葡萄球菌对上述10种抗菌药物的最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)值，根据CLSI的标准进行结果的判定。(金黄色葡萄球菌ATCC29213为质控菌株)。

1.2.4 耐药基因检测

DNA模板制备方法如下：对纯化后的葡萄球菌重新在BP琼脂平板上划线接种，37℃恒温培养箱培养24～48 h后，刮取1～2接种环菌苔加入50 μL TE中，100℃煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清作模板，-20℃保存备用。

进行5类7种耐药基因的检测，包括：β-内酰胺类的mecA和femA耐药基因、四环素类的tetA基因、喹诺酮类的norA基因、酰胺醇类的cfr和fexA基因，以及林可胺类的ermB基因。PCR产物经1.0%琼脂凝胶电泳后，PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司进行测序，获取的序列利用NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST程序进行比对。耐药基因的引物序列。表1

2 结果与分析

2.1 葡萄球菌分离鉴定

研究共采集不同动物粪源共计样品798份，共分离出葡萄球菌554株，葡萄球菌总体分离率为69.4%。其中，采集猪粪源样品100份，分离葡萄球菌48株，分离率为48.0%；采集牛粪源样品198份，分离葡萄球菌127株，分离率为64.1%；采集羊粪源样品200份，分离葡萄球菌116株，分离率为58.0%；采集鸡粪源样品300份，分离葡萄球菌263株，分离率为87.7%。表2

2.2 不同动物源葡萄球菌MIC

研究表明,猪粪源葡萄球菌对阿米卡星、庆大霉素、阿莫西林/克拉维酸、氟苯尼考、氧氟沙星、利福平、头孢噻呋、克林霉素、四环素、苯唑西林10种抗菌药物的耐药率依次为3.0%、22.7%、30.3%、43.9%、59.1%、63.6%、66.7%、74.2%、83.3%、84.8%。其中氧氟沙星、利福平、头孢噻呋、克林霉素、四环素、苯唑西林耐药率均超过50%。

鸡粪源葡萄球菌对阿米卡星、阿莫西林/克拉维酸、利福平、庆大霉素、氧氟沙星、头孢噻呋、氟苯尼考、克林霉素、苯唑西林、四环素10种抗菌药物的耐药率依次为7.4%、17.8%、35.2%、40.3%、41.6%、44.0%、79.5%、88.9%、91.9%、93.0%。氟苯尼考、克林霉素、苯唑西林、四环素耐药率均超过75%。图1

图1 不同动物粪源葡萄球菌的耐药率
Fig.1 Resistance rate ofStaphylococcusin different animals

表1 被检耐药基因的扩增引物序列及片段长度Table 1 Primer sequences and amplification fragment length of the resistant gene

表2 不同动物粪源的葡萄球菌分离结果Table 2 Separation of Staphylococcus from different animals

羊粪源葡萄球菌对庆大霉素、阿米卡星、氟苯尼考、氧氟沙星、阿莫西林/克拉维酸、四环素、头孢噻呋、利福平、克林霉素、苯唑西林10种抗菌药物的耐药率依次为4.2%、15.6%、19.3%、44.8%、45.3%、50.5%、53.1%、53.1%、67.7%、72.9%。

牛粪源葡萄球菌对氟苯尼考、阿莫西林/克拉维酸、四环素、克林霉素、氧氟沙星、利福平、头孢噻呋、苯唑西林8种抗菌药物的耐药率依次为1.4%、2.9%、7.2%、11.6%、32.6%、33.3%、34.1%、59.4%。牛粪源葡萄球菌对阿米卡星和庆大霉素均100%敏感。牛粪源葡萄球菌整体耐药情况比其他3种动物粪源葡萄球菌耐药情况较轻。图1

2.3 不同动物粪源葡萄球菌多药耐药结果

研究表明,鸡粪源葡萄球菌主要以4耐(24.8%)和5耐(25.2%)为主，占50%，且有9株菌对被检的10种抗菌药物全部耐药；猪粪源葡萄球菌以5耐(13.6%)、7耐(16.7%)和8耐(18.2%)为主，占48.5%；羊粪源葡萄球菌主要以1耐(12.5%)、2耐(12.5%)、5耐(12.5%)和8耐(13.5%)为主，占51.0%；牛粪源葡萄球菌以0耐(23.2%)、1耐(26.8%)和3耐(22.5%)为主，占72.5%。图2

图2 不同动物粪源葡萄球菌的多药耐药率比较
Fig.2 Comparison of multidrug resistance rates of Staphylococcus from different animals

2.4 不同动物粪源葡萄球菌耐药基因检测结果

用PCR方法检测5大类7种耐药基因检测结果显示。猪粪源葡萄球菌和鸡粪源葡萄球菌检出率最高的是ermB，检出率分别是70.8%和93.5%；羊粪源葡萄球菌和牛粪源葡萄球菌检出率最高的是femA，检出率分别是22.4%和17.3%。图3

图3 不同动物粪源葡萄球菌的耐药基因检测
Fig.3 Staphylococcus resistance gene detection in different animals

3 讨 论

3.1 不同动物粪源葡萄球菌耐药情况

研究结果显示，猪源菌对四环素、氧氟沙星、头孢噻呋、苯唑西林、利福平、克林霉素6种抗菌药物耐药率超过50%。鸡源菌对四环素、苯唑西林、氟苯尼考、克林霉素4种抗菌药物的耐药率超过50%，且鸡源菌对四环素和苯唑西林的耐药率超过90%。羊源菌对四环素、头孢噻呋、苯唑西林、利福平、克林霉素5种抗菌药物耐药率超过50%。而牛源菌仅对苯唑西林一种抗菌药物的耐药率超过50%。耐药程度由高到低依次为猪粪源葡萄球菌>鸡粪源葡萄球菌>羊粪源葡萄球菌>牛粪源葡萄球菌。猪粪源葡萄球菌对被检抗菌药物耐药最严重，结合采样发现，当今猪场集约化养殖是现代畜牧业发展的方向，但是很多养殖户其设施设备还未达到标准化的要求，为追求利润的最大化，往往会选择超规模养殖，导致生猪生存环境差，易发病。生猪发病后，养殖户为了不亏本，盲目选择药物、多药物配伍、加大剂量给与治疗，使发病的生猪在不规范用药的环境中被动摄入多类且量大的药物，在无形之间导致细菌耐药性的增加。研究结果显示，猪粪源葡萄球菌对过去治疗葡萄球菌的β-内酰胺类、四环素类和林可胺类均有较高的耐药率，这可能与该类药物被长期、大量不合理使用有关[2]。所以为了防止耐药性的产生，临床用药时应注意严格掌握适应症，不滥用抗菌药物，单一抗菌药物有效的就不要采用联合用药，保证用药剂量和用药持续时间。其次规模化养殖的鸡场环境普遍较差，鸡群作为高密度集中饲养的食品动物，养殖户为确保鸡群的健康，防止发病后出现大规模死亡等现象，在日常管理中不得不使用大量的抗生素，增加养殖成本，导致细菌对各种抗生素产生了耐药性，疗效下降，陷入了“耐药-换药(加药)-再耐药”的迷途困境，治疗之路越走越窄[11]。羊粪源葡萄球菌和牛粪源葡萄球菌耐药情况相对不严重，原因可能是动物处于半放牧的饲养方式，使用抗菌药物时无法集中给药，导致动物摄入的抗菌药物含量偏少。

3.2 不同动物粪源葡萄球菌耐药基因检测

实验共检测了β-内酰胺类(mecA，femA)、四环素类(tetA)、喹诺酮类(norA)、酰胺醇类(cfr、fexA)和林可胺类(ermB)7种耐药基因。耐药基因检出结果显示，鸡粪源葡萄球菌和猪粪源葡萄球菌耐药基因携带率最高的是ermB。羊粪源葡萄球菌和牛粪源葡萄球菌耐药基因检测率最高的是femA。结合药敏试验结果可以看出，羊粪源葡萄球菌、牛粪源葡萄球菌和猪粪源葡萄球菌耐药基因检出结果与耐药结果基本一致，羊粪源葡萄球菌对被检测的β-内酰胺类抗菌药物苯唑西林和头孢噻呋的耐药率超过50.0%；牛粪源葡萄球菌对被检测的β-内酰胺类抗菌药物苯唑西林耐药率高达59.4%，对头孢噻呋的耐药率也达到34.1%；而猪粪源葡萄球菌对被检测的林可胺类抗菌药物克林霉素的耐药率高达74.2%，以上结果表明，耐药基因的携带是细菌对抗菌药物产生耐药的主要原因之一。值得注意的是，鸡粪源葡萄球菌对四环素类耐药率最高，但四环素类耐药基因tetA检出率未超过10.0%，对被检测的林可胺类抗菌药物(克林霉素)的耐药率仅为18.5%，但林可胺类耐药基因ermB的检出率却最高，出现这种结果的原因可能是鸡粪源葡萄球菌对四环素的耐药不是由四环素耐药基因tetA所介导，可能存在其他未检测的耐药基因(如tetB)，甚至是存在新的耐药机制。耐药基因共存结果显示，除羊粪源葡萄球菌，其他3种动物粪源葡萄球菌均以ermB+fexA基因共存为主，这与3种动物源葡萄球菌对林可胺类和酰胺醇类抗菌药物耐药程度呈正比关系。

4 结 论

霍城地区不同动物粪源葡萄球菌对被检抗菌药物耐药情况严重，对被检抗菌药物的耐药率在3.0%～93.0%，耐药程度由高到低依次为猪粪源葡萄球菌>鸡粪源葡萄球菌>羊粪源葡萄球菌>牛粪源葡萄球菌，多药耐药情况严重，且存在多种耐药基因共存情况，以携带ermB和femA基因为主。新疆霍城县不同动物粪源葡萄球菌在治疗细菌性疾病时，需慎用酰胺醇类及林可胺类药物，合理交替轮换使用抗生素有利于缩短治疗周期，提高治疗效果，亦能有效减少耐药菌的产生。