超声波联合研磨破壁法提取雨生红球藻中虾青素的工艺研究

孟 昂，王 萌，赵晓燕，朱运平，张晓伟，刘红开，朱海涛

营养品质

超声波联合研磨破壁法提取雨生红球藻中虾青素的工艺研究

孟 昂1，王 萌1，赵晓燕1，朱运平2，张晓伟1，刘红开1，朱海涛1

（1. 济南大学 食品科学与营养系，山东 济南 250022；2. 北京工商大学 食品与健康学院，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048）

在比较研究并确定破壁方法与溶解试剂的基础上，利用超声辅助提取方法探索不同条件下从雨生红球藻中提取虾青素的效果，并通过响应面法进一步优化提取工艺参数。结果表明，采用液氮研磨破壁处理，以乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）作为提取溶剂在超声时间18 mins、超声温度39 ℃、液料比9∶50（mL/mg）、超声功率200 W条件下进行震荡超声处理，最后于40 ℃水浴振荡20 mins，虾青素提取率可达85.1%。

雨生红球藻；虾青素；液氮研磨破壁；溶解试剂；超声辅助提取

虾青素（Astaxanthin，AXT）是一种橙红色色素，主要存在于藻类（如雨生红球藻）和海洋生物（如撒蒙鱼）中。其生物合成途径可分为两个阶段，一部分是先经MEP途径及MVA途径合成β-胡萝卜素，然后由β-胡萝卜素经β-隐黄素→金盏花黄质→玉米质途径或经β-胡萝卜素-4-酮→斑蝥黄质→金盏花红素途径合成AXT[1]。由于AXT分子中含有亲脂性主体长链和亲水性端部，可使其较好的嵌入细胞膜内且不对膜造成损伤，从而有效发挥抗氧化等生物活性。

从天然材料中提取AXT的常规技术通常依赖于使用有机溶剂的固液萃取而无较多辅助因素的参与，导致提取率较低[2]。目前发展的一些高效提取方法如超分子溶剂提取、磁辅助提取、离子液体介导，由于成本太高而无法普遍应用[3]。超声辅助提取（UAE）是一种声波辅助分离系统，即在常规提取方法的基础上，利用超声机械作用，使溶剂最大程度地渗透到材料组织中，从而增加固相和液相之间的接触表面积，使溶质迅速从固相扩散到溶剂中，提高提取率[4]。本实验以雨生红球藻为原料，先进行破壁条件与浸提溶剂的筛选，在此基础上利用UAE探索不同条件下从雨生红球藻中提取AXT的效果，并通过进一步优化实验得出最佳提取工艺参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

AXT标准品：美国Sigma公司；雨生红球藻：云南时光印记生物科技有限公司；乙醇、乙酸乙酯：国药集团化学试剂有限公司。

SHZ-C恒温水浴震荡锅：常州市国旺仪器制造有限公司；V-5000可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；KQ3200DB数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；LCJ-IIB低速大容量多管离心机：上海安亭科学仪器厂；电子分析天平：上海佑科仪器仪表有限公司；TGL16M台式高速冷冻离心机：盐城市凯特实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 AXT标准曲线的绘制

准确称取5 mgAXT标品，用乙酸乙酯：乙醇（v/v：1∶2）溶液溶解并定容至50 mL，即得到100 μg/mL的AXT标准溶液，然后稀释至10 μg/mL，经紫外可见光谱扫描[5-6]，如图1所示，可得到最大吸收波长（480 nm）。在测定标准曲线时用10 μg/mL的溶液分别稀释至0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4 μg/mL，然后在480 nm处测定吸光度。

1.2.2 破壁方法的确定

玻璃珠振荡破壁[7]：称取200 mg藻粉置于棕色带盖锥形瓶，沿瓶壁依次放入10个玻璃球，加入10 mL乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）混合试剂，盖盖并用封口膜密封，将样品瓶置于恒温水浴振荡器，40 ℃、180 r/min振荡提取60 min，经10 000 r/min离心并过滤，收集滤液然后进行定容、稀释、比色测定。以不加玻璃球作对照。

图1 AXT标准品全波长扫描图谱

低温研磨法破壁[8]：称取适量藻粉经液氮研磨两次，每次0.5 min，准确称200 mg藻粉置于棕色锥形瓶，加入10 mL乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）混合试剂，将样品瓶置于恒温水浴振荡器，40 ℃、180 r/min振荡提取60 min，经10 000 r/min离心并过滤，收集滤液然后进行定容、稀释、比色测定。以不用液氮研磨作对照。

1.2.3 提取溶剂的确定

有文献已表明乙酸乙酯-乙醇混合试剂对AXT的提取效果明显优于乙酸乙酯[9]，故本文选择乙酸乙酯-乙醇混合试剂作为提取试剂，研究不同混合比例对提取效果的影响。分别称取200 mg经低温研磨处理后的藻粉放入棕色三角瓶，各加入10 mL乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶1；1∶2；1∶3）混合试剂，将样品瓶置于恒温水浴振荡器，40 ℃、180 r/min振荡提取60 min，经10 000 r/min离心并过滤，收集滤液然后进行定容、稀释、比色测定。

1.2.4 超声辅助提取雨生红球藻中AXT及AXT含量的测算

提取步骤：称取100 mg处理后的藻粉→加入适量乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）混合试剂→超声处理→40 ℃水浴振荡20 min→4 800 r/min离心20 min→收集上清液→稀释100倍→480 nm下测吸光度。

取0.1 mLAXT提取液置于10 mL容量瓶中，并用乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）混合试剂定容至刻度线，在480 nm处测定吸光值。根据公式（1）计算AXT提取率[9]：

：AXT提取率；：AXT浓度；：稀释倍数；：提取液定容体积；M：藻粉质量。

1.2.5 紫外吸收光谱的检测

取适量AXT提取液，以乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）混合试剂作空白对照，在200~1 000 nm波长范围内进行紫外可见分光光度扫描，检测提取液性质[10]。

1.2.6 超声处理单因素实验

1.2.6.1 超声时间对提取率的影响 选择超声时间为0、5、10、15、20、25、30、40 min，在超声功率为200 W，超声温度40 ℃，添加试剂20 mL（100 mg藻粉）的条件下进行震荡超声处理，以提取率作为衡量指标，确定最佳超声时间。

1.2.6.2 超声温度对提取率的影响 选择超声温度为0、30、35、40、45、50 ℃，在超声功率为200 W，超声时间15 min，添加试剂20 mL（100 mg藻粉）的条件下进行震荡超声处理，以提取率作为衡量指标，确定最佳超声温度。

1.2.6.3 超声功率对提取率的影响 选择超声功率为80、120、160、200 W，在超声温度40 ℃，超声时间15 min，添加试剂20 mL（100 mg藻粉）的条件下进行震荡超声处理，以提取率作为衡量指标，确定最佳超声功率。

1.2.6.4 液料比对提取率的影响 选择添加试剂为5、10、15、20、25、30、40 mL（100 mg藻粉），在超声温度40 ℃，超声时间15 min，超声功率200 W的条件下进行震荡超声处理，以提取率作为衡量指标，确定最佳液料比。

1.2.6.5 震荡超声对提取率的影响 在超声温度40 ℃，超声时间15 min，超声功率200 W，添加试剂20 mL（100 mg藻粉）的条件下，一份选择震荡超声处理，一份选择则静置超声处理，以提取率作为衡量指标，确定震荡超声处理效果。

1.2.7 响应面优化实验

利用Design-Expert.V8. 0.6软件[11]，以AXT提取率为响应值（），选择液料比（100 mg藻粉）、超声时间、超声温度为变量进行响应面设计。实验参数安排如表1。

表1 因素水平表

2 结果与分析

2.1 AXT标准曲线的绘制

根据方法1.2.1得出AXT浓度与吸光值的关系并绘制AXT标准曲线，如图2。可得回归方程= 0.281 8+ 0.028 4，² = 0.998 7，其中为AXT浓度，为吸光值。

图2 AXT标准曲线

2.2 破壁方法的确定

以不经任何处理样品作为对照，选择不同破壁方法处理藻粉结果如图3。以吸光值作为衡量标准，可以看出，与对照组（0.767）相比，藻粉经液氮研磨破壁处理后，AXT的提取效果（0.778）增强，而加入玻璃球震荡辅助提取（0.768）的作用效果无变化。故该实验选择破壁方法为液氮研磨破壁。

图3 不同破壁方法对AXT提取效果的影响

2.3 提取溶剂的确定

选择被批准用于食品加工工艺的有机溶剂[12]：乙醇和乙酸乙酯，并进行提取试剂的筛选，结果如图4。以吸光值作为衡量标准，从图中可以看出，混合试剂的提取效果顺序为乙酸乙酯-乙醇混合试剂v/v：1∶2>v/v：1∶1>v/v：1∶3，且v/v：1∶1与v/v：1∶3，提取效果无明显变化。本实验选择提取试剂为乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）混合试剂。

图4 不同提取溶剂对AXT提取效果的影响

2.4 紫外吸收光谱的检测

图5为AXT提取液全波长扫描图谱，可以看出，AXT提取液在波长为480 nm处有最大吸收峰，其测定结果与AXT标准品一致，可以说明提取液中AXT作为主要成分存在。

图5 AXT提取液全波长扫描图谱

2.5 超声处理单因素实验

2.5.1 超声时间对提取率的影响

以提取率及提取量作为比较参数，实验结果如图6所示。可以看出，AXT提取率的变化趋势随超声时间的延长先升后降，且在超声时间为20 min时达到最大，提取效果可达85.8%，AXT含量为17.16 μg/mg。而在超声20 min之后，AXT的提取效果呈明显下降，其原因是超声的穿透作用导致AXT的空间结构发生改变[13]，体现在吸光值的降低。本实验选择超声提取时间为20 min。

图6 超声时间对AXT提取效果的影响

2.5.2 超声温度对提取率的影响

以提取率及提取量作为比较参数，实验结果如图7所示。在40 ℃之前，AXT提取率随温度的升高而升高，达到40 ℃时，提取率达到最大82.6%，AXT含量为16.52 μg/mg。继续升高温度，提取率不增反降，其原因可能是在于AXT经超声波作用后，其结构中C==C、—OH、—CHO等基团更易受到热力作用而降解[14]，从而影响提取量。考虑到AXT本身是一种不耐热分子，本实验避免出现40 ℃以上的温度。

图7 超声温度对AXT提取效果的影响

2.5.3 超声功率对提取率的影响

以提取率及提取量作为比较参数，实验结果如图8所示。AXT提取率随超声功率的增强而上升，当超声功率达到最大时，AXT提取率可达80.9%，此时AXT含量为16.17 μg/mg。从提升效果角度可以看出，在超声功率160 W以后，AXT的提取效果趋于平缓，其原因是在超声波机械力的作用下，固液两相接触接近饱和[15]，所以提取趋势增幅减缓。本实验选择超声功率200 W。

图8 超声功率对AXT提取效果的影响

2.5.4 液料比对提取率的影响

以提取率及提取量作为比较参数，实验结果如图9所示。从总体变化趋势可以看出，随着提取试剂的加入，AXT提取率呈先升高后下降趋势，AXT最大提取率在料液比为1∶5时，此时AXT提取量可达16.86 μg/mg。在液料比1∶20至1∶5之间，AXT提取率的变化平缓，而当液料比大于1∶5后，AXT的提取呈明显降低趋势，其原因是由于溶剂量的增大，超声波带来的空化作用增强[16]，即进入溶液中气泡的数量增多而带入过多的氧气，AXT与氧气的接触导致其结构的破坏呈现提取率的下降。本实验选择超声料液比为1∶5。

图9 料液比对AXT提取效果的影响

2.5.5 震荡超声对提取率的影响

以提取率及提取量作为比较参数，实验结果图10所示。与静置超声处理藻粉相比，在震荡超声条件下，AXT提取效果有明显上升的趋势，提取量可从14 μg/mg增加到16.4 μg/mg。在震荡条件下，AXT分子可以从粉体细胞中快速游离出来而充分溶解于提取溶剂，本实验选择震荡超声。

图10 震荡超声对AXT提取效果的影响

2.6 响应面优化实验

2.6.1 回归模型的建立

通过方法1.2.7得出响应值如表2所示，利用表2响应面结果进一步做出方差分析如表3，得到液料比、超声温度、超声时间对提取率的影响模型（%）=85.00–2.25–3.14–1.89– 1.45–1.75–0.075–2.512–9.592–4.392，2=0.993 7。由表3可知，<0.000 1，显著水平极其明显，且失拟相=0.110 9，则该模型成立。通过值可知，除项交互作用对的影响不显著外，、、、、、2、2、2各项对均有显著影响。该模型2adj=0.985 5，表明AXT提取效果的变化有98.55%来自于本实验设定 因素，可利用该模型对AXT的提取条件进行优化选择。

表2 响应面实验设计和结果

表3 回归方程方差分析表

注：**代表极显著水平<0.01。

2.6.2 各因素的交互作用

设定因素交互作用对AXT提取率的影响如图11~13所示。通过曲面弧度及等高线陡度反应设定因素交互作用强度，可以看出，、项等高线图均呈现椭圆形，且3D响应曲面弧度呈现先升后降趋势，说明、项对AXT得率影响较大；而项等高线几乎为圆形，说明BC项对AXT的得率几乎无影响，与2.5.1结论对应。通过Design-Expert 8.0.6可得设定单元提取AXT最优配比：液料比18.21 mL，超声时间18.57 min，超声温度38.67 ℃，此配比下AXT提取率高达85.75%。从实际操作角度考虑，现把设定单元分别改成18 mL、18 min、39 ℃，以此作为新设定单元并进行验证，最终提取结果为85.1%，与统计软件预测分析值相比，几乎无明显差异。说明该数据模型可用于实际操作当中。

图11 AB响应面3D图及等高线

图12 AC响应面3D图及等高线

图13 BC响应面3D图及等高线

3 结论

本研究利用UAE方法对破壁后的雨生红球藻进行AXT提取工艺参数的优化及确定。首先进行原料预处理以初步减少提取阻力，然后通过对比选择溶解度最佳的提取试剂，以此为基础筛选出最佳超声处理条件并得出优化数据。本研究实验结果为：采用低温研磨对藻粉进行破壁，进而以乙酸乙酯-乙醇（v/v：1∶2）作为提取溶剂在超声时间18 min、超声温度39 ℃、液料比9∶50（mL/mg）、超声功率200 W条件下进行震荡超声处理，最后于40 ℃水浴振荡20 min，提取效果高达85.1%。

本实验通过机械方法对藻粉两次破壁处理（低温研磨初次破壁，震荡超声二次破壁），大大提高AXT的提取效率。随着AXT功能价值进一步挖掘，其相应价值也必然进一步提升，目前天然AXT在全球市场上的价格高达2.5~7 $/g，而AXT纯品价值更是高达3 200 $/g[17-18]，可见对原材料中AXT的有效提取是获得AXT来源的有效保障。

[1] WU Y Q, YAN P P, LIU X W, et al. Combinatorial expression of different β-carotene hydroxylases and ketolases in Escherichia coli for increased astaxanthin production[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2019, doi: 10. 1007/s10295- 019-02214-1.

[2] GAO J, FANG C, LIN Y, et al. Enhanced extraction of astaxanthin using aqueous biphasic systems composed of ionic liquids and potassium phosphate[J]. Food Chemistry, 2020, 309: 125672.

[3] KHOO K S, CHEW K W, OOI C W, et al. Extraction of natural astaxanthin from Haematococcuspluvialis using liquid biphasic flotation system[J]. Bioresource Technology, 2019(8), 290: 121794.

[4] YU R, KYUNGH. Comparison of ionic liquids and deep eutectic solvents as additives for the ultrasonic extraction of astaxanthin from marine plants[J]. Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 2016(6), 99: 197-203.

[5] 符力丹. 雨生红球藻中虾青素的微胶囊化及其稳定性研究[D]. 济南大学, 2016.

[6] 马密霞, 刘接卿, 胡文祥. 紫外分光光度法测定马钱子中士的宁的含量[J]. 中国医疗前沿, 2007(18): 20-22.

[7] 赵立艳. 雨生红球藻中虾青素的分离提取及其性质的研究[D]. 中国农业大学, 2006.

[8] 周湘池, 刘必谦, 曾庆国, 等. 雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)破壁方法对虾青素提取率的影响[J]. 海洋与湖沼, 2006(5): 424-429.

[9] 徐健. 雨生红球藻中虾青素的提取及虾青素对皮肤细胞损伤的保护作用[D]. 浙江大学, 2016.

[10] 吴娇, 刁庆宇, 白雪, 等. 雨生红球藻的培养及虾青素的提取与检测[J]. 大连民族大学学报, 2019, 21(5): 406-411.

[11] 徐煜, 张琳, 李亚鹤, 等. 雨生红球藻中虾青素萃取工艺优化[J]. 生物学杂志, 2017, 34(1): 98-102.

[12] ZEZERE B, SILVA J M, PORTUGAL I, et al. Measurement of astaxanthin and squalene diffusivities in compressed liquid ethyl acetate by Taylor-Aris dispersion method[J]. Separation and Purification Technology, 2020(5), 234: 116046.

[13] 马晓彬. 果胶酶促降解中的超声波作用途径及机理研究[D]. 浙江大学, 2017.

[14] 张海华, 朱科学, 周惠明. 超声波对小麦面筋蛋白结构的影响[J]. 中国农业科学, 2010, 43(22): 4687-4693.

[15] 张苗, 刘晓娟, 刘欣. 超声辅助提取雨生红球藻渣多糖工艺优化[J]. 食品工业科技, 2016, 37(20): 254-257+262.

[16] MACHADO I, FACCIO R, PISTON M. Characterization of the effects involved in ultrasound-assisted extraction of trace elements from artichoke leaves and soybean seeds[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2019, 59: 104752.

[17] BI W T, TIAN M L, ZHOU J, et al. Task-specific ionic liquid-assisted extraction and separation of astaxanthin from shrimp waste[J]. Journal of Chromatography B, 2010, 878(24): 2243-2248.

备注：本文的彩色图表可从本刊官网（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/ index.axpx）、中国知网、万方、维普、超星等数据库下载获取。

Extraction of astaxanthin fromby ultrasonic combined grinding and wall breaking

MENG Ang1, WANG Meng1, ZHAO Xiao-yan1, ZHU Yun-ping2, ZHANG Xiao-wei1, LIU Hong-kai1, ZHU Hai-tao1

(1. Department of Food Science and Nutrition, Culinary School, University of Jinan, Jinan, Shandong 250022, China; 2. School of Food and Health Engineering, Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Based on the determination of wall breaking method and dissolving reagent, ultrasonic-assisted extraction was used in this study to explore the effect of extracting astaxanthin from Haematococcus pluvialis under different conditions, and further optimize the test results by response surface methodology. The results showed that under the conditions of ultrasonic time of 18 mins, ultrasonic temperature of 39 ℃, liquid-material ratio of 9∶50 (mL/mg), and ultrasonic power of 200 W, ultrasonic treatment was carried out under the condition of oscillating ultrasound. Finally, the treatment was carried out under the condition of water bath oscillation at 40 ℃ for 20 mins, the astaxanthin extraction rate can be 85.1% using Liquid nitrogen grinding broken wall treatment with ethyl acetate-ethanol (v/v: 1∶2) as the extraction solvent.

; astaxanthin; liquid nitrogen grinding broken wall; solubilizing reagent; ultrasonic-assisted extraction

TS202

A

1007-7561(2020)03-0091-07

10.16210/j.cnki.1007-7561.2020.03.014

2019-11-28

国家自然科学基金（21406133），北京食品营养与人类健康高精尖创新中心开放基金（20181018）

孟昂，1993年出生，男，在读硕士生，研究方向为天然产物与功能食品开发.

赵晓燕，1975年出生，女，副教授，硕士生导师，研究方向为食品理论与加工应用及生物粉体技术研究.