HPLC-DAD法同时检测饼干中10种合成色素

李世娟 王延龙 齐伟杰

摘 要：建立了食品中10种合成色素（柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性红、赤藓红与酸性橙Ⅱ）的高效液相色谱法。本法定量检出限为：0.4～0.6 mg/kg，10种色素在1～20 mg/L范围内线性关系良好，相关系数均高于0.999，加标回收率为88.4%～96.1%，相对标准偏差为0.83%～5.24%。本方法检测简便、快速、准确、特异性强，非常适用于样品数量大、检测项目多的食品检测机构。

关键词：HPLC-DAD；合成色素；食品

目前，检测合成色素的国标方法有液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法、微柱色谱法等，但大多数方法仅能同时检测少数几种色素。因此，针对基层食品检测实验室人员少，样品种类多，检测项目复杂，工作量大的现状，研究出了能同时检测食品中的10种常见人工合成色素的方法，能够大大缩减检测周期、减低检测成本、提高检测效率。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

液相色谱仪U-3000配DAD检测器（美国Thermo Fisher Scientific公司）；C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm，Diamonsil Plus公司）；KQ-700DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TGL-20M低温离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）。

1.2 试剂

甲醇（色谱纯），乙酸铵（色谱纯），屈臣氏超纯水。

石油醚、乙酸锌、亚铁氰化钾、氨水、乙醇均为分析纯。

乙酸铵溶液（10 mmol/L）：0.77 g乙酸铵加水溶解定容至1 000 mL，并超声10 min。

乙醇-氨溶液： 取1 mL氨水，加入到100 mL 70%乙醇中。

亚铁氰化钾溶液（106 g/L）：称取106 g亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]加水至1 000 mL。

乙酸锌溶液（220 g/L）：称取220 g乙酸锌[Zn（CH3COO）2·2H2O]溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，加水稀释至1 000 mL。

1.3 样品处理

称取2.0 g粉碎后的样品于15 mL离心管，加入8 mL乙醇-氨溶液，涡旋均匀后超声提取10 min，加亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各1.0 mL，混匀后于5 000 r/min离心5 min，取适量上清液过0.22 μm滤膜，上机。

1.4 标准曲线

将浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0 μg/mL与20.0 μg/mL的标准系列溶液进行液相分析，以峰面积与标准系列溶液浓度进行线性回归分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 流动相的确定

实验发现，水相中乙酸铵的浓度在10～20 mmol/L范围内时，各组分均有较好的分离效果，但在梯度洗脱条件下，高浓度的乙酸铵流动相在有机相比例波动较大的情况下混合析出结晶，从而降低色谱柱的使用寿命，因此，水相中乙酸铵的浓度设定为10 mmol/L。

2.1.2 柱温的确定

考察了柱温为25、30、35 ℃和40 ℃时各组分的分离效果，发现柱温在此范围内均能有效分离，随着温度的升高，出峰时间略微缩短，但柱温为30 ℃时各组分的峰形尖锐且分离度较好，因此选择柱温为 35 ℃。

2.1.3 检测波长的确定

使用DAD检测器对各组分标准溶液在210～600 nm下进行光谱扫描，测得各组分最佳吸收波长分别为柠檬黄428 nm、新红523 nm、苋菜红534 nm、胭脂红513 nm、日落黄494 nm、诱惑红509 nm、亮蓝595 nm、酸性红512 nm、赤藓红529 nm以及酸性橙492 nm。再根据各组分出峰顺序，发现部分组分在可见光区内的最佳吸收波长范围有重合，经过多次优化，设定出可见紫外检测程序。见表1。

2.1.4 色谱图

通过高效液相色谱分离，二极管阵列检测器检测，优化色谱条件后10种人工合成色素得到有效分离，10种合成色素混合标准溶液的色谱图如图1所示，样品在400～600 nm波长下无明显杂质干扰。

2.2 样品处理条件的优化

2.2.1 提取液的选择

分别用去离子水，1%氨水和乙醇-氨溶液提取样品，发现去离子水和1%氨水对赤藓红和酸性橙Ⅱ的提取率偏低，乙醇-氨溶液能用有效提取所有色素，同时具有一定的沉淀蛋白的作用。

2.2.2 沉淀剂的优化

分别用0.5、1.0、1.5 mL与2.0 mL沉淀剂进行实验，1.0 mL沉淀剂能够有效去除样品中蛋白，沉淀剂过多会使色素的回收率降低。

2.3 标准曲线的线性范围和检测限

对混合标准系列溶液在色谱条件下进行进样分析，以溶液浓度为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标进行线性回归，回归方程及相关系数见表2。

3倍信噪比时所对应的浓度為出检出限。

2.4 回收率及精密度实验

分别称取空白样和加标样各2份，其中2份加标样分别加入100 μL浓度为1 mg/L的10种色素混标溶液，按照1.3进行处理后上机检测，结果取平均值，计算回收率。对其中一份加标样平行检测6次，计算RSD值，相关结果见表3。

3 小结

本方法简化了前处理步骤，不需要再进行固相萃取和浓缩步骤，大大缩短了前处理时间。采用绝大部分干扰物无响应的400～600 nm的波长进行检测，避免大部分食品添加剂和天然色素的干扰。结果表明，该方法准确、快速、简便、定量结果可靠，非常适合同时处理多批次样品。