甲基红褪色光度法测定大米中过氧化氢酶活性

董 娜 张爱菊 张小林

(甘肃医学院，平凉 744000)

植物果实在逆境或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使过氧化氢(H2O2)发生累积，H2O2可进一步生成羟自由基，可直接氧化核酸蛋白质等大分子物质，破坏细胞膜，加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶(CAT)是最重要的酶促防御系统，可清除H2O2，保护细胞正常生活，其活性与植物抗逆性密切相关。

大米在储藏过程中的新鲜度有很多评价指标[1]，过氧化氢酶活性是其中之一[2]，其常见的检测方法为国家标准中的碘量法和高锰酸钾滴定法[3-5]，即通过滴定CAT催化H2O2反应后剩余的H2O2与碘化物作用生成碘量的变化或消耗高锰酸钾的量计算CAT活性。滴定法优点是所用设备简单，缺点是测定中凭肉眼观测滴定终点，存在较大的人为判断误差，以及操作中滴定液流量的控制误差等。除此之外，其他领域还有多种方法报道，包括紫外光度法[6-8]、荧光分析法[9]、化学动力学光度法[10-14]等。董娜等[14]以二苯胺磺酸钠为底物完成CAT显色动力光度法测定，但显色灵敏度有限，H2O2表观摩尔吸光系数ε<5.0×102L/(mol·cm)。

甲基红是一种偶氮基有色染料，摩尔吸光系数ε=5.0×102L/(mol·cm)，遇氧化剂氧化降解而褪色，褪色程度与氧化剂的量有确定的函数关系[15]，在硫酸介质中能被过氧化氢氧化为无色，Fe3+可以加速氧化反应进程，通过CAT加入前后吸光度变化值实现酶活性测定。

目前过氧化氢酶活性单位表述不统一，多采用μmol/(min·mL)[16]，酶活性定义为：1个单位的过氧化氢酶是指在pH为7.0、25 ℃下每分钟能分解1 μmol的H2O2。国家标准规定酶活性的单位是mg/g[1]，即以每克组织样品中过氧化氢酶含量的多少来表示其活力的大小。该法具有相对的权威性，但没有对酶液做出特别说明。实验证实，酶催化反应速度完全取决于底物中酶量多少。本实验采用μmol/L(U/L)表示酶液酶活性，采用μmol/g(U/g)表示固体组织样品中酶活性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

宁夏长粒香米、宁夏普通大米、东北长粒香米、东北普通大米：均为2017年、2018年产。

CAT标准品：配制浓度1 mg/mL(5 000 U/mL)，高锰酸钾标定后配成1 U/mL；0.1 g/L甲基红(乙醇溶解，含0.6 g/L EDTA)；0.01 mol/L Fe3+溶液：称取5 g硫酸铁铵于50 mL烧杯中，加入0.02 mol/L的H2SO4溶液20 mL，待溶解后移入100 mL容量瓶中，用水稀释至100 mL，摇匀；5×10-4mol/L甲基红乙醇溶液(含φ=95 %的乙醇)；2 mmol/L H2O2基质液；2 mol/L H2SO4溶液；0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=7.0)；实验用水为二次蒸馏水，试剂均为分析纯。

7230G型可见分光光度计。

1.2 方法

1.2.1 过氧化氢酶活性的测定

1.2.1.1 甲基红褪色光度法

向50 mL容量瓶中加入35 ℃预热5 min后的CAT样液(酶活小于1 000 U/mL)1.00 mL、H2O2基质液4.00 mL，混合反应20 min后立即加入2.5 mL硫酸终止反应。然后依次加入甲基红5.00 mL，Fe3+溶液2.5 mL，摇匀，40 ℃水浴60 min后加水定容，用1 cm比色皿，以蒸馏水为参比，于510 nm处测定吸光度A。同时完成酶空白实验吸光度A0测定，根据ΔA(ΔA=A0-A)确定过氧化氢酶活性E。

1.2.1.2 高锰酸钾法和碘量法

对宁夏长粒香米用高锰酸钾法和碘量法进行测定[3]，实验平行测定6次，计算原样品酶含量(U/g)，并与甲基红褪色光度法作比较。

1.2.2 大米样品测定

分别称取3.00 g(已扣除水分)过筛后的8种大米粉，加入50.00 mL、pH=7.0生理盐水，研磨振荡混合后定容至1 000 mL，过滤，取滤液2.00 mL，测定过氧化氢酶活性，实验平行6次，并测定回收率。

2 结果与分析

2.1 吸收光谱与最大吸收波长

不同体系吸收光谱见图1所示。空白体系(不含H2O2和CAT)在510 nm处有最大吸收，峰形尖锐，峰值较高，甲基红(MR)摩尔吸光系数ε=2.52×104L/(mol·cm)；非酶体系(不含CAT)保持原有峰形，这说明H2O2与MR仅存在单纯的褪色反应；加入CAT后，褪色程度受抑制(酶促体系)，峰位未发生改变，这说明引起褪色反应的核心物质是过氧化氢，在过氧化氢取值一定时，褪色程度与过氧化氢酶活度有一定的函数关系。实验选取510 nm作测定波长。

图1 吸收光谱图(E=0.1 U/mL)

2.2 褪色反应催化剂选择

设定H2O2的浓度为0.16 mmol/L，针对非酶体系实验考察不同金属离子催化性能。结果表明：Fe3+、Fe2+和Mn2+对H2O2氧化甲基红褪色反应均有催化作用，但性能有差异。Fe2+酸性环境下更易被H2O2氧化，阻抑和催化并存，Mn2+优于Fe2+；相对而言Fe3+作用更为显著，Fe3+依托其特有的中强度氧化性，在H2O2和甲基红之间构建一条电子通道。因此选择Fe3+作催化剂。

2.3 甲基红用量考察

甲基红溶液的颜色和吸光度值取决于溶液酸度和甲基红用量，控制pH≤2，测定甲基红溶液吸光度A，在V=0.00～7.00 mL范围内，A与V有很好的线性关系。为了减少测量误差，将测量体系吸光度控制在0.200～0.700范围内，实验确定甲基红用量为5.00 mL。

2.4 底物H2O2用量设置

仅针对酶空白体系，改变H2O2的量，使反应液中H2O2分别为0.00、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 mmol/L，按实验方法完成褪色反应。由图2可知：当H2O2的浓度在0.00～0.20 mmol/L时，H2O2的用量与吸光度呈线性关系，当H2O2的浓度达到0.24 mmol/L时，甲基红完全被降解，吸光度趋于0，因此，选择H2O2浓度为0.16 mmol/L，即2 mmol/L H2O2体积设定量为4.00 mL。

图2 底物H2O2用量

2.5 褪色反应温度及时间

分别在25、30、35、40、45、50、60 ℃条件下完成褪色反应。室温下，褪色反应缓慢；40 ℃时反应60 min，线性关系最好。

2.6 硫酸用量

酶促反应的终结和氧化褪色反应均需要硫酸，硫酸介质又能有效克服Fe3+溶液水解，确保甲基红溶液颜色恒定；避免酶液加入后出现二次浑浊。取酶标准液6.00 mL，其他条件不变，仅改变硫酸用量，测定吸光度和溶液pH。当V<2 mL时，pH=0.9，ΔA有最大值。实验选用硫酸体积2 mL。

2.7 酶促反应时间影响

在底物浓度为0.16 mmol/L、30 ℃条件下，加入酶标准液3.00 mL和6.00 mL，分别反应1、2、3、4、5、6、7、8、9 min，作出酶促反应曲线。由图3可知：两条曲线变化趋势完全一致，在反应0～3 min和5～20 min内，酶促反应速率与时间成正比，单位时间内ΔA变化一致，符合酶促催化一级反应特征。20 min后，A值趋于稳定。因此，确定酶促反应时间为20 min。

图3 反应时间与反应速率的关系

2.8 工作曲线

取过氧化氢酶标准溶液0.00～1.00 mL作测试液，在最佳条件下完成ΔA测定，绘制工作曲线(图4)。过氧化氢酶活力E在0～0.12 U/mL范围内与ΔA呈良好的线性关系：ΔA=0.001+2.276E，r=0.998 9，按实验方法平行测定空白10次，标准偏差s为0.005，3倍的信噪比求得检测限为0.007 U/mL。

图4 工作曲线

2.9 干扰实验

取0.50 mL作测试液过氧化氢酶标准溶液作测试液，按照试验方法考察生物组织共存还原性物质干扰情况。结果发现，浓度小于基底液1/2浓度的葡萄糖、果糖、维生素C、乳糖、半乳糖不影响ΔA测定，测量误差小于1%。

2.10 大米样品分析

大米样品分析及回收率实验结果见表1。

由表1可见2018年份的大米优于2017年份，其中，2018年份的成品宁夏长粒香米、宁夏普通大米、东北长粒香米、东北长粒大米酶含量依次为213.58、195.83、112.66、91.50 U/g。酶含量越多，保鲜度越高，因此，2018年份的长粒香米具有更高的性价比。该方法精密度检验RSD=2.09%～4.57%，加标回收率在96.01%～102.40%范围内，说明粗酶液共存物质不影响酶活性测定。

用高锰酸钾法和碘量法对宁夏长粒香米进行测定，并与甲基红褪色光度法作比较，结果见表2。

表1 样品分析及回收率实验结果(n=6)

注：加标物来自购置品，经本法测得CAT活性后，作为已知活性的添加物。

表2 3种过氧化氢酶的测定方法比较 (n=6)

甲基红褪色光度法、高锰酸钾法和碘量法的标准偏差S分别为1.63、1.91和2.37，甲基红褪色光度法与高锰酸钾法合并标准偏差SR为1.78，t=1.49，查表得t0.05,10=2.228，即t

3 结论

过氧化氢与甲基红能够发生褪色反应，褪色程度与酶活性有函数关系。在最佳条件下，最大吸收波长510 nm，甲基红用量5 mL，过氧化氢用量4 mL，硫酸用量2 mL，褪色反应温度及时间为40 ℃、60 min，CAT活性E与ΔA呈良好的线性关系：ΔA=0.001+2.276E(U/mL)。该方法可简单、快速测定不同产地、不同年份大米的过氧化氢酶活性。