化学指纹图谱检测技术在茶叶领域的应用

郭小媛 董俊杰 叶 影 叶俭慧* 梁月荣

(1.浙江大学茶叶研究所，浙江 杭州 310058; 2.浙江骆驼九宇有机食品有限公司，浙江 杭州 310000)

茶是世界主流饮品之一，具有独特风味和多重保健功效，如降血压、降血脂、抗辐射、抑菌消炎等。茶多酚(主要包括儿茶素类化合物和黄酮醇类化合物)、氨基酸、咖啡碱和香气物质是茶叶重要的品质成分，与茶的生理活性有关。茶叶的化学组分受到茶树品种、加工方式、采摘季节和栽培环境等因素的影响，与此同时也是茶树鲜叶对外界环境刺激反应的结果，不同样品之间成分的差异，如同人的指纹一般表征茶样各自的特质。

近年来，指纹图谱技术已越来越多地应用于药用植物和食品领域的品质控制和鉴定。基于检测对象，指纹图谱技术大致可分为两大类：化学指纹图谱和生物指纹图谱。化学指纹图谱主要借助多种分析化学检测手段，获得与检测样品相关的波谱数据，结合化学计量法，得到表征样品特征信息的指纹图谱[1-3]；生物指纹图谱的构建依托分子生物技术、计算机统计分析技术等，包括DNA指纹图谱和蛋白组学指纹图谱等[4]，对检测技术和计算机统计分析技术要求较高。化学指纹图谱可获得多重组分含量，与茶叶的品质特征具有直接相关性，且检测手段和技术相对更为常见，同时具备系统性、全面性和可比性等优势。本文就近年来化学指纹图谱技术检测和分析机理及其在茶叶研究领域的应用进行了综述。

1 常用的化学指纹图谱检测技术

化学指纹图谱检测技术主要涉及化学指纹的提取和计算机分析处理两个方面。目前常见的提取化学指纹图谱的检测技术主要包括色谱、近红外/中红外光谱和非靶向质谱检测。

1.1 色谱检测分析技术

色谱检测分析技术主要包括液相色谱和气相色谱。高效液相色谱(HPLC)和超高压液相色谱(UHPLC)是应用最广的液相色谱检测技术。液相色谱技术基于样品溶液中各组分在固定相和流动相的分配系数差异，利用高压高速使得各组分随流动相在色谱柱内经反复多次吸附-解吸后产生流速差异而分离，再经检测器将浓度转换为电信号以色谱图形式输出。常见的液相检测器有紫外/可见光检测器、光电二极管矩阵检测器、示差折光检测器、荧光检测器、电化学检测器，可用于多种类型化合物的检测。液相色谱技术具有分离效果佳、稳定性好、检测精度高等特点，且对样品的热稳定性与挥发性无要求，适合多组分的物质的定性和定量分析[1-2]。而UHPLC在超高压的条件下进行，相对分析时间更短、分离效果更好且溶剂消耗量和样品上样体积少，且通常与质谱一同联结使用，适用于样品化学组分的高通量定性和定量分析[5]。 图1 为不同波长下绿茶UHPLC色谱图[6]。可以根据物质对紫外波段的吸收特性，选择不同的紫外波段进行物质的定量分析，图1中360 nm处对黄酮醇苷物质进行检测， 280 nm处对儿茶素类化合物进行检测。对于未知物质的液相色谱图，可以通过比较色谱图各个峰的位置和面积，结合化学计量法，获得样品的特征图谱以及样品间的差异。

气相色谱技术(gas chromatography， 简称GC) 是研究茶叶挥发性成分的主要手段。通常以惰性气体(如氦气)作为载气，各组分在两相间经反复多次的吸附-脱附而彼此分离，在检测器中将浓度变化转化为相应的电信号，在记录器上得到各组分的色谱峰，通常联结质谱进行定性分析。气相色谱检测的精度和准确度受到挥发性物质提取和衍生方法的影响。目前常用的萃取方法有常压蒸馏萃取法(SDE)、减压蒸馏萃取法 (VDE)、超临界萃取法(SFE)、顶空吸附法(HAS)、固相微萃取(SPME)、顶空固相微萃取( HS-SPME)等。相对于其他萃取方法的长时间高温蒸馏、大量使用有机溶剂、结果重现性差等缺陷，SPME法集样品的采集、萃取、浓缩、进样一体，萃取条件相对温和，且灵敏度高、重现性较好[7-10]，近年来已较多应用于茶叶挥发性成分的检测[11-15]。目前，通过GC-MS已从茶叶中检测出50余种香气挥发性物质[16-23]。

当目标物质沸点较高时，可通过衍生化反应改变目标物质的原子或基团，降低目标物的沸点，便于检测。GC-MS常用的衍生化方法有硅烷化、酰化、烷基化。硅烷化试剂是GC-MS分析中应用最广的衍生化试剂，在酚类、胺类、酸类化合物的衍生分析中都能发挥很大的作用，三甲基硅烷是GC分析最常用的通用硅烷化试剂[24-25]。结合衍生技术，GC-MS不仅仅用于挥发性物质的检测，还可用于较高沸点物质的检测，是全面研究样品化学组分的有效手段之一[26]。胡慈杰等采用衍生法结合气质联用技术，从茶汤中同时检测出26种氨基酸，43种可溶性糖、43种有机酸等171种代谢产物，对应的GC-MS总离子流色谱图如图2所示[27]。茶香气指纹图谱结合化学计量法在区别名优茶香气类型，明确特征香气组分，基于化学成分的感官科学和感官评价等方面具有应用前景[28-32]。

1.2 近红外/中红外光谱检测技术

红外检测技术是基于不同有机物官能团对红外光波段具有不同吸收，从而获得物质结构和含量信息的技术。根据红外波段，可分为近红外(4000～12820 cm-1)与中红外(400～4000 cm-1)技术。根据特征吸收峰的波数位置和强弱，可对茶叶中特定化学组分含量进行初步检测，可用于茶叶的无损检测，在判定茶叶类型， 快速测定基础化学成分方面具有应用前景[33-35]。在中红外光谱波段内，1300～4000 cm-1波段可用于官能团结构解析，400～1500 cm-1波段被称为“指纹区”，即每个样品拥有其独一无二的特征光谱波段[36-37]。表1为儿茶素类化合物在400～4000 cm-1波段内不同官能团所对应的特征吸收峰，根据特征吸收峰的吸收值可对不同茶样进行分类和区分[38]。

1.3 非靶向质谱检测技术(Non-target MS)

质谱检测主要是利用高能电子流轰击样品，生成具有不同质荷比的带电离子，通过其在磁场中发生偏转，捕获后确定分子或分子碎片分子量，可分为有检测目标的靶向质谱检测技术和非靶向质谱检测技术。基于高分辨质谱的非靶向质谱检测技术(Non-target MS)，通过分子量小数点后四位，比对化合物分子量数据库，从高精度分子量角度判定物质成分，目前已应用于代谢组学等方面的研究，在检测样品中的未知成分方面具有优势，然而非靶向质谱检测技术对仪器设备和从业技术人员要求较高，且关于特定组分的定量分析仍需进一步通过液相等方法进行确认[39]。

注：表内数据改编自参考文献[37-38]。

2 常用的化学计量法

指纹图谱数据需结合化学计量法通过统计分析，获得有效结论。常用的化学计量法有主成分分析(PCA)、聚类分析(CA)、人工神经网络法(ANN)、偏最小二乘判别分析法( PLS-DA)等。不同分析方法的联用，可以互证结果，有应用于茶类判别、茶原产地溯源、茶树亲缘溯源等[40-42]。最常用的PCA是利用降维的思想，将多个指标转化为少数几个综合指标(一般是原指标的主成分)，以客观确定的权数得到数据间影响因素的贡献率的分析方法；聚类分析(CA)的特点是根据研究对象的个体特征(即一些能度量样品间相似程度的统计量)，将不同样品进行相近性归类[7]。人工神经网络法(ANN)是通过不断逼近从无规律和模糊的大量数据中提炼出趋势和倾向性，在处理海量且规律不明的数据上有明显优势，如建立茶叶品种的判别分类模型[43]。偏最小二乘回归法(PLS)基于多元线性回归模型，对所有变量进行分解后提取因子间的相关性，再按相关性由大而小排列，得到线性模型(如Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3+…+bpXp)，可以在此基础上选择因子参与后续建模。判别分析(DA)是基于一定判别标准，利用一个或多个判别函数将样品进行归类的分类方法。对于判别分析而言，准确有效的判别函数往往起着关键性作用。PCA提取相关性较高的变量以简化展示不同样品间的异同，但某些相关性很小的有用变量很可能被忽视，而PLS采用多变量的回归建模方式可以弥补这一缺陷，其中PLS-DA是最常见的方差分析法[36]。

3 指纹图谱技术在茶叶领域的应用

基于化学组分的指纹图谱技术与化学计量法相结合，在辨别茶叶原料的品质、溯源地，区分制作工艺，判定茶叶等级等方面具有应用价值，近年来已成为茶叶研究领域热点之一[44]。该技术的建立和推广对于制定茶叶等级的客观评定体系，设定茶叶质量标准，明确茶叶溯源地，维持茶叶市场健康发展具有积极意义。

3.1 溯源地区分

不同地域的茶叶通常具有不同的品质特征，这是由于不同产地的地理环境和气候差异导致了茶叶化学组成的差异。胡燕和齐桂年(2014年)比较了来自四川、湖南、湖北、云南、广西和陕西6省的37个黑茶样品的红外吸收光谱，通过聚类分析结合二阶导数谱的相似度分析可以区分不同产地黑茶样品，此外还通过HPLC-DAD-ELSD联用技术，构建了不同产地黑茶的HPLC指纹图谱，为黑茶产地鉴别和质量控制提供了参考[38，45-46]。He Yong等(2007年)对八种不同产区的绿茶样进行近红外光谱检测，基于PCA法得到8个主成分并应用于反向传播神经网络的输入，建立了BP-ANN模型。试验结果表明通过WT和PCA对40个未知样品的光谱数据预处理后，利用该模型进行种类预测，识别准确率达到了100%[43]。He等(2012年) 结合偏最小二乘分析和欧氏距离法对从中国浙江省四个不同地区收集的857个茶样品的近红外光谱数据进行分析，采用两步判别法建立判别模型，能够有效验证茶样品的真实性和来源，对校正集和验证集茶样的识别准确率分别达到98.43%和96.84%，[36]。辛中权(2017年)采用色谱质谱联用技术对云南和湖南两个产地的72批绿茶样品进行化学成分检测，建立了不同产地绿茶的色谱指纹图谱，并结合化学计量学方法构建了能够区分云南和湖南绿茶的判别模型[47]。中国茶叶种质资源丰富，不同品种、产区的茶叶适制性亦不同，尤以名优茶类对茶叶原料的要求更高，指纹图谱技术在识别茶叶产地上的准确率和普适性仍有待提高。

3.2 不同茶类和等级区分

不同茶类因加工工艺的差异直接导致干茶中化学组分的含量和种类的显著区别，如绿茶中氨基酸含量较高，发酵茶类含有茶红素、茶黄素、茶褐素，而绿茶由于杀青工艺不含有儿茶素类的氧化产物。不同采摘标准和原料配比制作出的干茶在滋味和内含成分上也有较大差异，如茶嫰叶的氨基酸、咖啡碱含量高于老叶，而老叶的纤维素含量较嫩叶高等。Yang Zhao等(2011年) 运用UPLC-DAD-MS对普洱生茶、绿茶、白茶进行化学成分检测，并采用主成分分析(PCA)对茶叶样品进行区别和归类，结果表明优化的UHPLC指纹技术结合化学计量法能够较好地对茶叶样品进行分类[48]。陈维等(2018年)对不同堆青处理的白茶样品进行GC-MS全扫描检测，通过香气组分差异结合PCA成功区分不同堆青处理的白茶样品，并建立聚类分析谱系图[7]。Anupma Sharma等采用RP-HPLC对Kangra，Darjeeling和Nilgiri三个产区的印度红茶样品进行化学成分检测，PCA结果显示可以依据茶叶萎凋和发酵的不同程度来区分不同产区的茶，该结果有助于开发HPLC在线监控系统对茶叶加工过程进行技术控制[49]。利用色谱指纹图谱与品质成分检测结果，结合计算机模型建立茶叶综合评价体系和等级评判标准，进而构建茶叶科学的质量监测体系，这已成为当前茶叶领域研究的热点。

3.3 茶树品种区分

我国具有丰富的茶树品种资源，茶树品种间内含组分有明显差异，这是茶树生长生态条件的多样性和人工长期选择的结果。周健、王丽鸳等(2010年)对浙江省不同产区的四个不同品种的838份扁形绿茶进行红外光谱检测，结合PLS、欧式距离等分析方法成功区分所制干茶的不同品种(最终识别准确率：定标集为90.3%，验证集为83.5%)，为实现茶叶品种溯源提供了借鉴[50]。陈林等(2012年)基于铁观音、黄棪、金观音和黄观音四个品种春季新梢的游离氨基酸指纹图谱，结合化学计量法成功区分乌龙茶适制品种的类群，为清香型乌龙茶鲜叶原料的选取和制作工艺控制提供了参考[51]。王斌等(2017年)对22个安化黑茶样品以及云南普洱茶、湖北青砖茶、广西六堡茶、四川土司黑茶的主要化学成分进行色谱定量分析，找到了可用于安化黑茶鉴定和评价的标志性化学成分—茯砖素A[52]。Zheng等(2018)通过UHPLC-DAD-MS / MS同时测定茶叶中13种黄酮醇苷和8种儿茶素的浓度，结果表明黄酮糖苷含量具有明显的种间差异， 或可成为区别茶树品种的重要化学成分[6]。指纹图谱技术在茶叶品种判别方面的应用，有助于名优茶种质资源的保护和利用。

3.4 茶叶陈新区分

白茶、普洱茶的化学组分随着贮藏年份的增加而发生转变，主要表现为氨基酸和茶多酚含量下降，茶色素和水溶性蛋白等浓度上升，另有复杂多聚物的生成，这导致随着贮藏年份的增加茶叶品质特征发生明显变化。譬如新制成的白茶茶香气较清纯，而存放后会显现甜香毫香，随着存放年份的增加陈香、枣香出现，乃至发展成为“药香”。同样，普洱茶随着贮藏年份的增加品质也有明显变化，陈香更为明显，而滋味更醇和。研究表明基于普洱茶的红外光谱特征结合HPLC-MS技术和化学计量法，可区分普洱生茶和熟茶[53-54]。刘兴勇等(2015年)采用 HPLC检测了不同陈化年限的云南普洱茶的化学成分，通过聚类及判别分析建模可初步判定普洱茶的陈化年限(初始分组和交叉验证判别正确率分别为100%和89.5%)，但其准确率受到样品来源及加工工艺等因素的影响[55]。

3.5 数字化感官评价体系建立

目前，茶叶质量评价体系主要是感官评价定级外加相关生化成分检测。感官评价定级以专业人士审评为主，审评结果易受到审评员主观因素和外在环境的影响，较难实现大批量茶叶样品的同期审评，且审评结果的重复性有待考量。因而，建立起客观，公正，重复性高，同期处理量大的数字化感官评价体系是茶叶审评科学的主要发展方向。史波林等(2011年)利用电子鼻传感器分别检测西湖龙井茶的干茶、叶底和茶汤的香气，建立了正确率高达95%以上的西湖龙井茶等级判别模型[56]。Danqun Huo等(2014年)采用人造舌头和鼻子检测来自不同地域的绿茶茶汤或香气，结合PCA成功区分了不同地理来源和等级的中国绿茶[57]；王银诚等(2017年)采用电子舌对茶汤滋味进行检测、打分，结合PCA和CA分析对红茶滋味进行区分，其结果与人工审评结果一致[58]。基于化学组分、电子感官系统结合化学计量法建模进行茶叶感官审评和等级判定具有简单快速、结果客观、重复性高等优点，有助于促进茶叶感官评价的科学化和茶叶质量数字化控制体系的建立。

4 展望

基于化学组分的指纹图谱技术结合化学计量法，在茶叶的原产地和品种溯源，干茶等级和陈新区分、建立数字化感官评价体系方面具有应用前景。化学计量法分析结果的可靠性受到所采用的指纹图谱准确性和全面性的影响。由于茶叶种类繁多、工艺多样，导致茶叶的内含成分复杂且不同茶类之间存在较大差异，因此需进一步提高茶叶化学组分检测技术手段，从而获得更为可靠和全面的茶叶指纹图谱，用于化学计量分析，提高模型区分或判定的准确性。基于红外光谱技术的无损检测是目前食品类无损检测技术研发的热点，具有快速分析、操作简单、数据信息量大等优势；但由于物质官能团对红外光吸收灵敏度的限制，在采用红外光谱数据进行建模时，应采用较大的样品量进行建模，同时确定相应的样品选择标准和模型的应用范围。随着多重组学的发展，能检测和需要检测的物质大量增加，化学计量法的引入使得样品间差异信息的获取更有效率、识别准确率更高。通过统计学手段对获得的大数据进行分析从而获得可靠结论是未来食品化学发展的重要趋势之一。