百日咳鲍特菌MALDI-TOF MS谱库的扩展及鉴定效果评价

郄春花，刘亚敏，李颖，王玥，吴红章，孟超(天津市第二人民医院 .检验科,.感染科，天津300192)

百日咳是百日咳鲍特菌(Bordetellapertussis，Bp)感染引起的一种严重的急性呼吸道传染病。鲍特菌家族成员还包括副百日咳鲍特菌(Bordetellaparapertussis，Bpp)、支气管败血鲍特菌(Bordetellabronchiseptica，Bb)和霍氏鲍特菌(Bordetellaholmesii，Bh)等。目前Bp的实验室诊断主要依靠细菌培养、鼻咽拭子PCR检测[1]。传统的细菌培养后生化鉴定方法操作繁琐、耗时长。鼻咽拭子PCR检测灵敏度高，但容易产生假阳性。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)技术通过将待测微生物的特征蛋白质指纹图谱与已知微生物的特征蛋白质指纹图谱数据库比对,实现微生物的鉴定，可弥补生化反应耗时长的缺点。Bruker数据库包含10株Bp、11株Bpp和9株Bb等谱图信息，其他品牌质谱仪谱库尚未列入Bp谱图信息。由于菌株的地区差异较大，现有的质谱库并不能满足地方流行株的准确鉴定需求。本研究以本地区临床分离Bp进行质谱库的扩充以提升地方分离株的鉴定能力。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集天津市第二人民医院2018年3月至2019年8月自门诊和住院患儿(0～6个月)鼻咽拭子或呼吸道抽吸物培养分离获得的45株Bp和1株Bpp，挑取其中10株(9株Bp和1株Bpp)用于现有数据库的扩展，其余36株用于验证Bruker蛋白质指纹谱库扩展后的鉴定效果。所有菌株的最初鉴定采用Bruker公司的MALDI-TOF MS质谱技术，并经全基因组测序验证。金黄色葡萄球菌ATCC 29213、大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、铜绿假单胞菌ATCC 27853来自天津市临床检验中心。

1.2主要试剂与仪器 炭琼脂粉(英国Oxiod公司)，血琼脂平板(天津金章科技公司)，甲酸和乙腈(国药集团化学试剂公司)，QIAamp DNA Mini Kit(美国Qiagen公司)；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪、HCCA基质及质谱鉴定校准品BTS(德国Bruker公司)，高通量基因测序仪BGISEQ-500及高通量测序套装PE50(华大智造科技公司)。

1.3菌株分离培养及鉴定 所有菌株初代培养用炭琼脂培养基，挑取单个菌落转种于血琼脂平板。菌种经MALDI-TOF MS初步鉴定后，用QIAamp DNA Mini Kit提取全基因组DNA，应用超声波将DNA片段化后用于文库制备。单链环状DNA分子通过滚环复制，形成1个包含300多个拷贝的DNA纳米球。将得到的DNA纳米球采用高密度DNA纳米芯片技术，加到芯片的网状小孔内，通过联合探针锚定聚合技术进行测序[2]。全基因测序工作委托深圳华大基因公司完成。原始数据应用生物信息分析软件MegaBOLT进行数据质控，数据比对，变异识别，从而得到有效数据。测序读长300 bp、测序深度20倍、覆盖度92%。测序所得序列与GenBank数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的序列比对，获得菌株鉴定结果。

1.4数据库扩展 挑取1.3中9株Bp和1株Bpp，用于扩展布鲁克数据库Taxonomy(5989)。样品的前处理采用甲酸乙腈提取法[3]，取上清液1 μL点在96孔靶板上，室温下晾干，再加1 μL HCCA覆盖，室温下晾干后上机。靶板中心点位涂布校准品BTS，用于质谱仪器的内部校准。每个样品重复点8个样品孔，应用仪器Microflex LT软件，每个靶点采集3张质谱图，每个菌株采集24张质谱图并作为质谱文件保存。使用Biotyper 3软件分别调入所采集的9株Bp和1株Bpp的质谱图，根据Bruker主谱图(main spectral profile，MSP)创建要求，将同一菌株的24张质谱图(至少20张)汇总生成整合图谱，创建为该菌株的MSP。应用Biotyper 3软件将质谱图进行数据分析汇总，将创建的MSP导入布鲁克数据库Taxonomy(5989),扩展后的数据库命名为Taxonomy(5989+)。

1.5MALDI-TOF MS的准确性、精密度评价 参考文献[4]方法，对ATCC 29213、ATCC 25922、ATCC 700603、ATCC 27853各1株，进行MALDI-TOF MS鉴定，通过获得的鉴定结果与分值评价该方法的准确性。参考文献[5]方法，选取6株Bp传代培养，每个菌株取3个菌落分别制备靶板，用MALDI-TOF MS鉴定，以鉴定符合率评价方法的精密度。

1.6数据库扩展前后菌株的鉴定 按照1.4中方法制备36株待测菌靶板，分别用Taxonomy(5989)和Taxonomy(5989+)进行鉴定。依据Bruker仪器说明书，鉴定分值判断标准如下：分值为2.300～3.000，表示可信的种水平的鉴定；分值为2.000～2.299，表示可信的属水平的鉴定，可能的种水平鉴定；分值为1.700～1.999，表示可能的属水平的鉴定；分值为0.000～1.699，表示鉴定结果不可信。

2 结果

2.1全基因组测序结果 文库构建插入片段大小为300～400 bp，应用MegaBOLT软件进行基因组的从头组装，最终获得的有效数据片段大小为1 100～1 300 Mb。测序所得序列与美国国立生物技术中心(NCBI)库中的参考序列比对，其中1株鉴定为Bpp外，其余均鉴定为Bp。

2.2MALDI-TOF MS数据库的扩展 成功构建9株Bp和1株Bpp参考谱库，并扩展现有布鲁克数据库Taxonomy(5989)数据库为Taxonomy(5989+)。部分菌株MALDI-TOF MS质谱峰见图1。

2.3MALDI-TOF MS的准确性和精密度 用MALDI-TOF MS鉴定4株标准菌株ATCC 29213、ATCC 25922、ATCC 700603、ATCC 27853,鉴定分值均大于2.300，对鲍特氏菌鉴定无干扰，表明试验的准确性良好。6株Bp每个菌株分别取3个菌落进行鉴定，重复测定3次，鉴定符合率为100%，表明试验的精密度良好。

2.4数据库扩展对鉴定结果的影响 36株Bp建库前可信度分值为2.000～2.229者(准确鉴定到属)有28株，分值为1.7000～1.999者7株，无分值>2.300菌株；建库后可信度分值>2.300者(准确鉴定到种)有31株，占86.1%(31/36)，分值为2.000～2.229者(准确鉴定到属)有4株。

3 讨论

菌株蛋白质指纹图谱信息的丰富是准确鉴定菌株的基础，选择建库的菌株必须有代表性，要囊括尽量多的型别和不同的地区分离株，尤其要包括本地区种群的菌株，以便获得更好的匹配结果[6]。由于不同国家或地区的菌株具有一定的差异，建立适合本地区的Bp蛋白质指纹图谱数据库具有重要意义。

本研究选取经全基因组测序确认的9株Bp和1株Bpp临床分离菌株为基础，建立一个与商业数据库互补的扩展数据库。结果显示，建库前本院分离菌株的鉴定结果分值普遍偏低，建库后菌株鉴定结果可信度分值>2.300者提升到86.1%，表明建库后种水平鉴定结果可信度显著增高。相似的结果与Van den Bossche等[7]研究具有一致性。

MALDI-TOF MS技术从根本上改变了目前临床实验室对微生物鉴定的操作模式，为微生物快速鉴定带来了一场革命。由于Bpp、Bb等感染非常少见，本扩展库尚存在纳入菌株种类不足等缺陷。相信随着数据库的不断补充与应用软件的改善，MALDI-TOF MS不仅将在Bp的鉴定中体现快速、准确、高通量的特点，还会成为Bp分型和流行病学研究的有力工具。