基于网络药理学的人参、黄连“药对”治疗2型糖尿病作用机制研究

孙瑞茜 傅强 赵进喜

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一组常见的以葡萄糖和脂肪代谢紊乱、血浆葡萄糖水平增高为特征的代谢内分泌疾病，其引发的一系列并发症严重危害着人类健康。中医药治疗2型糖尿病(diabetes mellitus type 2，T2DM)有较好的疗效，课题组基于《内经》“壮热食气”的理论，结合长期的临床观察，提出T2DM的基本病机为热伤气阴，治疗强调清热益气养阴法的应用。

药对是两味药的配伍运用，可使立方疗效更彰，人参、黄连“药对”是古代医家常用的对药，也是清热益气法的代表性药物，唐代孙思邈的《千金方》里就有应用人参、黄连“药对”治疗“消渴病”的记载，汉末年代的《名医别录》中也提到人参、黄连有“止消渴”的作用，可见古人对于人参、黄连“药对”治疗糖尿病早有认识。现代研究发现，人参、黄连“药对”可以改善T2DM胰岛素抵抗，保护胰岛β细胞，其作用机制与下调胰岛中促炎细胞因子、促凋亡因子的表达，以及上调调脂联素受体的表达有关[1]，但其具体作用路径仍不是十分清楚。中药具有多成分、多靶点的特点，因为中药方剂的复杂性，其机制研究比较困难。网络药理学近来已经成为一种高效、系统地揭示中药方剂分子机制的新手段。网络药理学可以将药物作用所涉及的蛋白靶点纳入一个庞大的生物学网络中，通过分析这一生物学网络，不仅可以发现药物潜在蛋白靶标及靶标之间的相互作用，还可以发现靶标的功能以及对生物学网络的影响[2]，进而寻找药物的潜在作用通路，揭示中药的配伍规律，寻找新的适应症，为中药的现代化研究提供帮助。

本研究从网络药理学出发，通过相关数据库筛选人参、黄连“药对”的主要作用成分及靶点，并与T2DM疾病靶点进行匹配，筛选出人参、黄连“药对”治疗T2DM的潜在关键靶点，构建药物—靶点—疾病网络，通过GO富集及通路富集分析人参、黄连“药对”治疗T2DM的潜在作用机制，为进一步研究提供参考。

1 材料及方法

1.1 人参、黄连“药对”成分收集和筛选

使用TCMID(traditional Chinese medicine integrative database)、TCMSP平台(version 2.3，traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform)筛选人参、黄连两味药物化学成分。借助 TCMSP平台的参数筛选活性成分，设定药物成分口服生物利用度(oral bioavailability，OB) ≥30%，类药性( druglikeness，DL) ≥0.18[3-4]。

1.2 人参、黄连“药对”化合物靶点获取

使用蛋白—化合物相互作用数据库STITCH 5.0数据库[5]及DrugBank数据库检索候选活性成分靶点，限定物种为人，选择高置信度的靶点(interaction score≥0.7)，剔除没有靶点的活性成分, 建立化合物—作用靶点数据集。

1.3 T2DM相关靶点检索

基于TTD 数据库(therapeutic target database)、DrugBank数据库、GAD数据库 (genetic association database)和DisGeNET数据库，以“Type 2 Diabetes Mellitus”为关键词进行检索，筛选、整理T2DM相关靶点。

1.4 药物—化合物—关键靶点网络构建

将人参、黄连的活性成分所对应的靶点基因和T2DM相关的靶标基因进行匹配，获得两者的共同基因即为人参、黄连“药对”治疗T2DM的关键靶点。将靶点信息导入STRING 11.0数据库, 获得化合物—靶点蛋白相互作用关系，使用Cytoscape[6]软件(Version 3.5.1)构建“药物—化合物—靶点”关系网络及靶点蛋白相互作用网络，网络中的节点表示靶点, 边表示各靶点间的相互关系。

1.5 关键靶点GO分析及通路分析

DAVID数据库整合了生物学数据库和分析工具，可进行基因本体(GO)分析和KEGG通路分析，从大规模的基因或蛋白序列中挖掘特定基因或蛋白的生物学意义[7]。设定P<0.05，GO富集分析选择生物过程(biological process)和分子功能(molecular function)，通路富集分析选择 KEGG数据库。

2 结果

2.1 人参、黄连“药对”活性成分筛选

通过TCMSP数据库检索出人参化学成分190个，黄连化学成分48个，从TCMID数据库检索出人参化学成分294个，黄连化学成分30个，剔除重复化学成分，并通过OB≥30%和DL≥0.18进一步筛选得到人参的潜在活性成分29个，黄连潜在活性成分17个。

2.2 靶点收集

通过STITCH数据库和DrugBank数据库检索活性成分对应的作用靶点，人参对应的靶点有144个，黄连对应的靶点有246个。通过DrugBank数据库、TTD数据库和DisGeNET数据库，共收集到350个2型糖尿病相关靶点。将人参、黄连活性成分靶点和T2DM靶点匹配后，得到42个人参、黄连“药对”治疗T2DM潜在靶点。见表1。

2.3 网络关系构建

2.3.1 药物—化合物—靶点网络 将人参、黄连两味药物与其活性成分及关键靶点基因导入Cytoscape软件进行网络构建及可视化。见图1。结果表明，人参、黄连“药对”直接与疾病靶点基因相连的活性成分有12个。其中槲皮素(quercetin)、黄连素(berberine)、山奈酚(kaempferol)、花生四烯酸(arachidonate acid)、阿魏酸(ferulic acid)、豆甾醇(stigmasterol)等6个成分能与3个及以上的关键靶点基因相连，可能是人参、黄连“药对”治疗2型糖尿病的重要成分。同时，多个化合物又可以具有共同靶点，人参、黄连的共同靶点有15个，分别为VEGFA、UGT1A9、UGT1A3、UGT1A1、TNF、SLC2A4、PTGS2、PTGS1、CYP3A4、CYP2D6、CYP1A2、CYP1A1、AHR、ABCC1、ABCB1。

表1 人参、黄连“药对”活性成分治疗T2DM潜在靶点

图1 人参、黄连“药对”活性成分—靶点网络图

2.3.2 关键靶点基因蛋白质相互作用网络 将人参、黄连治疗T2DM的41个关键靶点导入String数据库获取蛋白相互作用关系，再导入Cytoscape软件绘制蛋白关系网络。见图2。该网络图共包括42个节点，229个边。以连接度(Degree)数值反映节点的大小，Degree指与该节点相关联边的条数。Degree数值越大，节点越大，表明这些靶点参与可更多的生物功能，在网络中具有重要地位。其中Degree值前五名的靶点有CYP3A4、CYP2B6、CYP2C9、TNF、VEGFA。为了进一步筛选出具有拓扑重要性的主要节点，计算了网络中每个节点的3个拓扑特征：Degree、介度(Betweenness)和紧密度(Closeness)。Degree、Betweenness和Closeness的中值分别为12、0.017和0.516。确定Degree>12、Betweenness>0.017和Closeness>0.516的节点为主要节点，这些节点可能在人参、黄连“药对”治疗T2DM中具有重要意义，共筛选出25个主要靶点，以这些节点构建基因调控蛋白相互作用网络(PPI)，并对网络进行生物过程、分子功能和通路富集分析。见表2。

表2 核心靶点及拓扑学参数

图2 人参、黄连“药对”治疗T2DM靶点蛋白相互作用网络

2.4 GO分析及通路富集分析

对人参、黄连的25个核心靶点进行GO富集和KEGG 通路分析，选择P<0.05的结果。生物过程富集结果见图3，可见靶点关联的生物过程主要有药物代谢过程(7个靶点)、外源化合物代谢过程(8个靶点)、外源性药物分解过程(5个靶点)、类固醇代谢途径(6个靶点)等。主要相关的靶点为CYP3A4及其亚型CYP1A1、CYP2B6、CYP2C9、CYP2C8、CYP1A2等。

分子功能富集结果见图4，人参、黄连“药对”核心靶点关联的生物过程主要有氧结合、咖啡因氧化酶活性、酶结合、单加氧酶活性、血红素结合、类固醇羟化酶活性、芳香化酶活性等，表明人参、黄连“药对”可以通过参与调控多种生物学功能发挥作用。

对人参、黄连核心靶点进行KEGG 通路富集,富集结果见图5，核心靶点富集到的信号通路有 AMPK信号通路(4个靶点)、NF-κB信号通路(3个靶点)、TNF信号通路(3个靶点)以及胰高血糖素信号通路(3个靶点)，可见人参、黄连“药对”可通过多通路协调发挥治疗T2DM作用。

3 讨论

网络药理学是中药研究的新技术、新方法，其研究理念与中医“整体观”的思想不谋而合，十分适用于中药复方的研究。现在，网络药理学在中药药理机制研究、新药发现以及不良反应、毒副作用研究等方面均取得了良好成果[8]

本次研究发现人参、黄连“药对”的主要活性成分中槲皮素、黄连素、山奈酚、花生四烯酸、阿魏酸、豆甾醇等拥有较多的预测靶点，表明这些化合物可能是人参、黄连“药对”中产生药理作用的重要化合物。其中黄连素治疗T2DM的机制已有很多研究，黄连素能够促进胰岛β细胞的修复和再生，活化胰岛素受体基因的表达、增加胰岛素敏感性，能够提高糖尿病大鼠胰高糖素样肽-1 (glucagon-like peptide 1，GLP-1)水平及胰岛β细胞的数量[9]，还可以调控多个信号通路。

图3 人参、黄连“药对”核心靶点生物学过程富集分析

图4 人参、黄连“药对”核心靶点分子功能富集分析

图5 人参、黄连“药对”核心靶点KEGG通路富集分析

将获得的人参、黄连的25个核心靶点进行GO分析和通路分析。GO分析和通路富集结果均显示人参、黄连“药对”治疗T2DM的作用与CYP3A4及其亚型介导的药物代谢有关。CYP3A4是参与人体药物代谢的主要酶系，约占人体肝、肠、肾药物代谢总反应的75%，其代谢速度影响化合物的药代动力学，也可能影响药效反应[10]，研究发现，糖尿病状态下一些药物的药动学会发生改变，可能与CYPs酶活性改变有关[11]。而中药可以通过诱导或抑制CYP3A4的活性, 加速或减慢其他药物在体内的代谢[12]。进一步研究人参、黄连对CYPs酶活性作用可能对研究药物相互作用、避免不良反应、促进合理用药具有重要临床意义。

此外，人参、黄连“药对”的核心靶点也和多个信号通路相关，其中TNF、PTGS2、IL1B是NF-κB信号通路、TNF信号通路的共同靶点。NF-κB通路是介导炎症反应的重要信号通路, 可以引起TNF-α、IL-1β等炎症因子表达，导致系列非特异性炎症反应，进一步引起胰岛素抵抗和糖代谢异常。靶点IGF1R、HNF4A、CFTR、SIRT1富集在AMPK信号通路上，AMPK通路是预防代谢综合征的重要通路，具有调节糖原异生和周围组织的葡萄糖利用功能[13]。一线降糖药二甲双胍发挥生物活性与激活AMPK通路密切相关，二甲双胍也可以抑制糖尿病大鼠骨骼肌TLR4/NF-κB/TNF-α炎症信号通路，增加胰岛素敏感性[14]。

分析结果显示，人参、黄连“药对”改善胰岛素抵抗的作用与PPARA、 TNF、 SLC2A2等靶点相关，PPARA的活化可以降低葡萄糖调节蛋白的表达,抑制血管损伤、脂毒性、炎症、血管生成和血栓形成介质的产生[15], 还有调节内质网应激的作用[16]。临床上贝特类药物是PPARA受体激动剂,可治疗血脂紊乱和T2DM。SLC2A2编码的葡萄糖转运蛋白2在胰岛β细胞、肝、肠、肾以及中枢神经系统中均有表达，可以帮助肝脏发挥血糖调节的功能, 参与刺激胰岛素分泌过程，和空腹血糖受损高胆固醇血症以及心血管疾病、T2DM的风险增加关系密切[17]，是糖尿病药物研发的重要靶标。本研究通过网络药理学方法对人参、黄连“药对”进行分析，发现了主要活性成分及其潜在作用靶点，通过靶点和通路分析讨论了其治疗T2DM的作用机制，但仍需要进一步实验数据的支持。此外，本研究也揭示了人参、黄连“药对”多成分、多靶点和多通路的协同作用的特点，符合中药方剂多组分、多功效、协同作用的特点，为进一步深入研究人参、黄连“药对”治疗T2DM的活性成分和作用机制提供了重要的线索和依据。