利用CRISPR/Cas9敲除大麦靶基因

(摘译)

(1.贵阳市花溪第一中学， 贵阳 550025； 2.贵州大学农学院， 贵阳 550025)

1 前 言

自CRISPR/Cas9首次在植物中应用以来，在几乎所有已实验物种中都是有效的[1-4]。植物中常用它在特定位点引入双链断裂(DSB)，再由宿主细胞的非同源末端连接(NHEJ)机制修复，从而导致一些核苷酸插入或缺失，若这些核苷酸位于靶基因编码区，可能造成功能丧失[5]。

化脓链球菌的Cas 9是一种RNA引导的核酸内切酶，与CRISPR(成簇规律间隔的短回文重复序列)II型适应性免疫系统有关[6]；该细菌利用Cas 9/gRNA复合物识别并切割外来DNA。gRNA由两个独立的RNA分子组成，它们先杂交然后再与Cas 9结合；2个RNA分子已经成功作为基因组编辑的单链向导RNA(sgRNA)[7]。通过剪切sgRNA的5′端(前间隔序列)，使其与靶位点互补，并为Cas 9加上核定位信号，可以在植物或其它真核基因组的特定位点引入DSB。

sgRNA靶点特异的5′端前间隔序列只有20个核苷酸，不论什么靶位点，它的其余部分都是一样的(图1)。Cas 9/sgRNA复合体能够查询基因组序列，并在匹配处引入DSB。sgRNA功能的关键决定因素是同源基因组序列是否紧接NGG，其通常被称为原间隔基序(Protospacer adjacent motif，PAM)。如果在基因组中发现23个碱基序列(20个来自sgRNA和PAM)，那么核酸内切酶将切割DNA。在高等真核植物中，最主要的修复机制是NHEJ，尽管许多修复将完全恢复至野生型，但有些修复将导致核苷酸的缺失或插入。

由于负责靶向的sgRNA长度较短，难以确保该序列(尤其较大基因组中)不存在其它脱靶位点。脱靶位点和原型间隔区之间错配，也会导致脱靶突变[5]。使用这23个核苷酸序列(Protospacer和PAM)进行BLAST搜索大麦基因组，及利用其它CRISPR/Cas9在线专用工具尽可能降低脱靶现象。

使用根癌农杆菌携带的T-DNA稳定转化大麦是一个有效方法[8]。使用4个转录盒(1个抗潮霉素盒、1个Cas 9核定位表达盒、2个小麦U 6启动子驱动靶点特异性sgRNA转录盒)，及将含T-DNA双元载体的农杆菌接种未成熟胚可以引入CRISPR/Cas9靶点突变；发现只有部分sgRNA是有效的，且诱变效率因sgRNA不同存在很大差异。为了筛选有效的sgRNAs投入了大量工作[9，10]，这虽然与哺乳动物基因组有关，但可能很好地应用于转基因大麦。所以，为了使所需转基因系数量最小化，优选含一对sgRNA的双元载体。

每个靶基因含2个双元sgRNA载体，每个载体含一对特异sgRNA，每个靶基因总共有4个sgRNA。即使效率最低情况下，只1/4 sgRNA具有功能，目前已全部完成了15个靶基因的敲除。在许多情况下，2、3或4个sgRNAs具有活性。使用双元sgRNA载体的另一个潜在优势是若2个sgRNAs都有活性，通常会删除整个序列[11]，如整个外显子。

注：(A)Cas 9/sgRNA复合物在染色体DNA上定位目标序列。sgRNA(黑体字母)5′端的20个核苷酸(前间隔序列)与染色体的上链互补，后面紧接着的是PAM，可使Cas 9产生DSB。无论什么靶序列，sgRNA的非可变部分(镂空字母)都保持不变。(B)DSB由NHEJ机制修复，导致较小的插入和缺失。

对于每个双元载体，通常做20个转基因系；然后，筛选T0系是否存在靶突变，从T0靶突变系获得T1代。播种T1代种子，由于基因分离，可能在T1株系出现丢失了T-DNA的靶突变体。T1代也可能分离出在T0亲本所得到的多种突变体，因此在T1代有可能获得非转基因的纯合突变体。

植物中突变体筛选有多种方法，比如，限制性内切酶/PCR法[12]。然而，发现将靶位点PCR扩增子直接测序是一种快速、简单且能输出详细信息的方法。Cas 9直接切割5′端与PAM间的20个碱基靶序列。如果存在插入或缺失序列，可能导致功能丧失，测序图谱通常由此切点变成双峰或三重峰(而野生型则是单峰)。另外，双元sgRNA的2个sgRNAs都具有活性，且同时切割2个靶位点获得较短的PCR扩增子(约2个靶点之间的距离)；与野生型相比，可以通过琼脂糖凝胶上条带迁移率很容易鉴别片段大小的差异。

将含有插入或缺失突变的T0系保存，种植留种。插入片段应与T-DNA分离，每个靶基因选取4个T0系进入T1，每株系播种24株(共96株)，鉴定出大量无T-DNA的突变体。通过PCR鉴定不含T-DNA的T1植株，并可使用与T0相同的PCR/测序方法筛选无T-DNA、理想的纯合突变体。

当T-DNA以孟德尔方式从T1植株中分离时，靶突变通常不会丢失。若编辑发生在T0早期(如再生植物的原始细胞)，T1突变率可达100%；若编辑发生在T0后期，突变效果不如早期，在1个基因座上可能含2个以上等位基因。

2 材 料

2.1 目标序列选择

可在Deskgen.com、http://plants.ensembl.org/ndex.html、https://ics.hutton.ac.uk/morexGenes/blast_page.html等网站搜索序列。

表1 sgRNA靶点特异性寡核苷酸模板

注：黑体代表限制酶位点的黏性末端。示例中PAM靶序列用下划线表示。

2.2 表达载体构建

寡核苷酸、引物、质粒、Bsa1、T 4连接酶、PCR仪、电感受态细胞、2 mm电穿孔试管、BioRad基因脉冲器Ⅱ、羧苄青霉素、IPTG、X-gal、质粒提取试剂盒、BigDye®循环测序试剂盒、Esp3I和BpiI、大观霉素、固体LB培养基、杂交缓冲液等。

2.3 大麦基因组DNA提取

缓冲液1(pH 7.5的Tris HCl 200 mM，250 mM NaCl，25 mM EDTA，0.5%SDS)，pH 8的Tris-EDTA(TE)等。

2.4 靶位点PCR扩增和测序

2×PCR混合物、PCR仪、引物、琼脂糖、10×TBE凝胶缓冲液、碱性磷酸酶(1 u/μL，65 ℃加热灭活)、外切核酸酶Ⅰ(10 u/μL，80 ℃加热灭活)等。

2.5 非转基因突变株鉴定

微孔带、2×PCR混合物、引物、PCR仪、DNA marker等。

3 方 法

3.1 大麦基因组靶序列选择

1) 在靶基因第一个外显子鉴别唯一的23 bp核苷酸序列，该序列应符合GN 20 GG模板，并且可以出现在正义链或反义链上。检查潜在的脱靶位点，以确保特异性突变。

2) 当4个靶基因检测了4个靶位点时，使用提取的基因组DNA模板设计和测试覆盖靶位点的PCR扩增子。PCR能扩增清晰的单一条带，纯化后直接测序得到覆盖靶区域的色谱图。

3) 若步骤2已完成，开始构建表达载体；若步骤2尚未完成，可在不同的区域或外显子中选择不同的靶序列。

3.2 表达载体构建

1) 使用限制性内切酶Bsa1或Esp3I克隆2个互补的寡核苷酸，向位置3或位置4引导受体添加1个合适的前间隔序列。按表1设计寡核苷酸序列(不包括PAM)。

2) 互补寡核苷酸中加2μM杂交缓冲液，95 ℃保持3 min进行杂交，然后自然冷却至室温。

3) PCR体系：100 ng位置3或位置4受体，1μL杂交的寡核苷酸对，1μL 10×T 4连接酶缓冲液，0.5μLBsa1或Esp3I，1μL T 4连接酶，加水至10μL。混合物进行如下循环:37 ℃，20 s；37 ℃，3 min，16 ℃，4 min，26个循环；50 ℃，5 min；80 ℃，5 min。

4) 将1μL混合物转化大肠杆菌感受态细胞，接种至含100 mg/L羧苄青霉素、0.1 mM IPTG，200μg/mL X-gal的LB琼脂培养基上37 ℃过夜培养。约选3个白色菌斑分别在含羧苄青霉素的10 mL LB液体培养基中37 ℃培养过夜；提取质粒DNA，并对质粒进行测序，检测寡核苷酸对是否被正确重组。体系包含200 ng质粒、1.5μL BigDye 3.1缓冲液、1μL 10μM引物、1μL BigDye 3.1，加水至6.5μL。进行如下循环：96 ℃，1 min；96 ℃，10 s，50 ℃，5 s，25个循环；60 ℃，4 min。结合位点周围的序列如下，转录的第1个碱基是从5′端G直接到NX 19，Ns表示原型间隔区序列，3′端的G表示sgRNA的非可变区段的开始。

5′-GCTTGCTGCATCAGACTTG(NX 19)GTTTTAGAG-3′

5) 完整的二元sgRNA载体转化农杆菌AGL 1菌株，再用以转入大麦，待T0植株生长14周后，采集叶片提取DNA用于PCR/测序。

3.3 大麦基因组DNA提取

离心管中加入适量叶片，加入600μL缓冲液Ⅰ进行研磨，离心10 min后取上清液，加入等体积丙二醇，离心20 min后，加入0.5 mL 70%乙醇洗涤沉淀，再次离心10 min，弃上清，沉淀风干后溶解于100μL的TE中。

3.4 PCR和靶位点测序

1) 在http://bioinfo.ut.ee/primer 3-0.4.0/primer 3/上设计引物，用野生型DNA进行检测和优化，以获得清晰的特异扩增产物。

2) 添加1μL基因组DNA，终浓度150 nM的引物，2×PCR混合物，20μL反应体系进行PCR扩增。

3) PCR扩增结束后，取5μL进行电泳检测。大片段缺失突变体比野生型的条带下移。

4) 15μL PCR产物加入1μL碱性磷酸酶(热灭活)和1μL外切核酸酶Ⅰ(热灭活)，37 ℃保持30 min后，80 ℃保持20 min；经PCR扩增后，送公司测序，将返回ABI文件供色谱检查。

5) 靶位点处的片段插入或缺失可能从预期Cas 9切割点附近开始出现双峰。

6) 播种突变体的T0系种子，在T1代继续检测突变体。

3.5 非转基因突变系鉴定

1) 把每个T0株系收获的40粒种子置于培养皿中潮湿滤纸上，4 ℃保存2 d后，放在24 ℃光照培养；种子发芽后(约4 d)移至大麦生长基质(2∶2∶1堆肥∶珍珠岩∶砂砾)，白天15 ℃，夜间12 ℃，相对湿度80%，500μmoL/(m2·s-1)光照下培养，生长约1周后，提取叶片DNA。

2) 采用PCR/测序(方法同上)检测插入或较大片段缺失突变体。这次由于染色体分离，很可能检测到纯合突变体。

3) 用含HptII编码序列的特异引物进行PCR扩增，以检测T-DNA是否存在。取5μL PCR产物，当T-DNA存在时，将扩增107 bp的单一条带，即T1系含转基因；不含T-DNA但含靶点突变的T1系则为非转基因突变体。此阶段大多为纯合突变，若仅鉴定出杂合突变或双等位突变，则需进入下一轮筛选。