STAT3正向调控正畸牙移动速率与牙槽骨骨量

张程， 陶贵渝， 黄鹂， 吕春晓， 李天成， 尹星， 邹淑娟

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院正畸科，四川 成都（610041）

安全有效地加快正畸牙移动速率是医患的共同愿望。增加破骨细胞活性，可导致压力侧牙槽骨吸收加快，从而达到提高牙移动速率的目的。如果成骨活动不能相应增加，则导致骨稳态失衡，牙槽骨骨量减少，进而增加牙齿松动、牙槽骨吸收、牙根吸收以及正畸治疗后复发的风险。因此，同时提高成骨、破骨活动是安全有效地加快正畸牙移动的可行方法。信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activatorof transcription 3，STAT3）与骨代谢关系密切。有研究显示，成骨细胞特异性敲除STAT3 的小鼠表现为骨形态异常、骨质疏松［1］；敲除或抑制破骨前体细胞内STAT3 导致破骨分化下降［2］；STAT3 也介导了骨细胞对于机械应力加载产生的成骨效应［3］。以上研究表明，STAT3 在成骨、破骨分化中均发挥作用，并对机械信号产生反应，由此推断STAT3 可能参与调控正畸牙移动骨塑建与骨重建。本研究探究了STAT3在调控正畸牙槽骨塑建速率及骨稳态方面发挥的作用，为安全有效提高正畸牙移动速率提供理论基础和潜在靶点。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

8 周龄雄性Wistar 大鼠（四川大学实验动物中心，SYXK（川）2018-185）。小鼠成骨前体细胞MC3T3-e1（亚克隆14）和小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7（均购自中国科学院昆明细胞库）。

DMEM 培养基（Gibco，美国）、胎牛血清（Corning，美国），stattic（Selleck，美国），抗坏血酸（百灵威，中国），β-甘油磷酸钠（Sigma-aldrich，美国），BCIP/NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒（碧云天，中国），抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染液试剂盒（凯基生物，中国），TRIzol（Invitrogen，美 国），TB Green®PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Takara，日本）。

1.2 实验动物分组

8 周龄雄性Wistar 大鼠40 只，体重（250 ± 20）g，随机平均分为2 组：对照组（牙移动），实验组（牙移动加局部注射STAT3 抑制剂stattic）（图1）。

以镍钛拉簧拉双侧上颌第一磨牙向近中移动建立牙移动模型，力值40 g。实验组于第一磨牙近中腭侧黏骨膜下注射10 μL 50 μM stattic 溶液，每隔1 日注射1 次，相邻两次注射间隔48 h，在建立牙移动的前两天开始局部注射；对照组注射等体积生理盐水。在牙移动的第7 天、第14 天每组分别随机处死10 只大鼠，收集双侧上颌骨。

1.3 Micro-CT 扫描及分析

Figure 1 Intra-oral picture of the device for orthodontic tooth movement and location of the local injection in rats图1 大鼠牙移动装置图及局部注射位点口内照

标本经4%多聚甲醛在4 ℃固定48 h 后，储存于4 ℃0.5%多聚甲醛溶液中等待扫描。扫描精度10 μm。在正中矢状向截面测量第一磨牙与第二磨牙牙冠之间的最小距离为牙移动距离，每个样本重复测3 次，取平均值。在第一磨牙根分叉处选取400 μm× 400 μm × 500 μm 的长方体作为研究对象，分析该区域牙槽骨的骨体积分数（bone volume/tissue volume，BV/TV）、骨小梁数目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁分离度（trabecular separation，Tb.Sp）、骨密度（bone mineral density，BMD）。

1.4 细胞培养

小鼠成骨前体细胞MC3T3-e1（亚克隆14）和小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7 扩增于含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM 培养基；加入50 μg/mL 抗坏血酸、10 mM β-甘油磷酸钠后成为成骨诱导培养基。两种细胞共培养于Transwell®培养板，下层接种MC3T3-e1，密度2.5 × 105个/孔；上层小室接种RAW264.7，密度5×105个/孔。共培养体系分为对照组和实验组。对照组使用普通成骨诱导培养基，实验组使用含5 μM stattic 的成骨诱导培养基。

1.5 ALP 染色

MC3T3-e1 经共培养3 d 后，以BCIP/NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒按说明书进行染色，显示成骨细胞内ALP 活性。

1.6 TRAP 染色

RAW264.7 经共培养3 d 后，以TRAP 染液试剂盒按说明书进行染色，显示TRAP 阳性细胞。

1.7 qRT-PCR

用TRIzol 法提取细胞总RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 合 成cDNA，TB Green®Premix Ex TaqTMII 进行qRT-PCR 检测，内参为GAPDH，所使用核因子κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor - κB ligand，RANKL）、骨保护素（osteoprotegerin，OPG）引物序列见表1。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 Sequences of primers for qRT-PCR

1.8 统计学分析

以SPSS 19.0 进行分析，计量资料以x±s表示。经检验，骨小梁形态学各项参数、牙移动距离、基因表达情况符合正态分布，各组方差齐；骨小梁形态学参数采用双因素方差分析及Bonferroni 校正进行组间比较；牙移动距离和基因表达分析采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 抑制STAT3 激活对正畸牙移动区松质骨微结构的影响

Micro-CT结果显示，对照组、实验组骨密度均随时间增加而降低。牙移动第7 天时，对照组和实验组第一磨牙根分叉处牙槽骨BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp 及BMD 无明显差异；第14 天时，实验组牙槽骨BV/TV、Tb.N、Tb.Th、BMD 较对照组相比明显下降，Tb. Sp 明显上升，出现骨质疏松表型（图2、表2、表3）。

2.2 抑制STAT3 激活对正畸牙移动速率的影响

第7 天时，实验组牙移动量明显低于对照组（P＝0.005）；在第14 天时，两组牙移动量差异无统计学意义（P＝0.307）（表4）。2.3 抑 制STAT3 激 活 对MC3T3-e1 与RAW264.7 共培养体系成骨、破骨向分化的影响

Figure 2 Micro-CT sagittal images of alveolar bone of the upper first molars at the bifurcation on day 7 and day 14 in two groups of rats图2 7 d、14 d 时2 组大鼠上颌第一磨牙根分叉处牙槽骨micro-CT 矢状向截面图

表2 2 组大鼠7 d、14 d 上颌第一磨牙根分叉处牙槽骨微结构micro-CT 测量值Table 2 Micro-CT measurements of the alveolar bone microstructure of the upper first molars at the bifurcation on day 7 and day 14 in two groups of rats x±s

与对照组相比，实验组处理3 d 后，共培养体系中MC3T3-e1 ALP 染色明显较浅，说明抑制共培养体系中STAT3 激活降低了ALP 活性，抑制成骨分化；RAW264.7 TRAP 阳性细胞数目明显减少，说明抑制共培养体系中STAT3 激活抑制破骨向分化（图3）。

表3 Micro-CT 测量值方差分析表Table 3 ANOVA table of micro-CT analysis

qRT-PCR 结 果 表 明，stattic 抑 制MC3T3-e1 RANKL、OPG 的mRNA 表达，且对OPG 的抑制作用更明显，RANKL/OPG 比值升高（表5）。

表4 2 组牙移动量随时间变化情况Table 4 Change in the amount of tooth movement with time in the two groups x±s,mm

3 讨 论

3.1 研究意义

提高牙移动速率一直是正畸学界基础和临床研究的热点。研究表明，应用骨皮质切开术［4］、激光［5］、局部震动法［6］及正颌手术后［7］牙槽骨代谢加快，牙移动速率增加。文献显示，STAT3 的激活同时加强成骨活动与破骨活动，但对正畸牙槽骨塑建的影响尚不清楚。本研究初步探索了STAT3 在正畸牙槽骨塑建与重建过程中的作用，为提高牙移动速率及改善牙槽骨稳态提供了理论基础。

Figure 3 The osteoblastic differentiation of MC3T3-e1 cells and the osteoclastic differentiation of RAW264.7 cells in the two groups图3 2 组MC3T3-e1 成骨分化及RAW264.7 破骨分化情况

表5 2 组MC3T3-e1 RANKL 和OPG mRNA 表达水平及RANKL/OPG mRNA 比值Table 5 mRNA expression levels of RANKL and OPG as well as the RANKL/OPG ratio in MC3T3-e1 of the 2 groups x±s

3.2 结果分析

炎症因子IL-6 已被证实参与正畸牙移动及牙周炎发展进程［8-9］。作为IL-6 重要的下游信号转导因子，STAT3 具有促进成骨和破骨的双重作用［10］。破骨前体细胞中，抑制STAT3 激活直接削弱RANKL 诱导下的破骨分化［11-12］。成骨分化依赖于STAT3 的激活，上调成骨细胞及间充质干细胞STAT3 激活水平增加其成骨能力及增殖活性［13-14］。STAT3 同时介导成骨活动与破骨活动的特性在本研究中也得到了证实。STAT3 对骨量的宏观影响取决于其对成骨与破骨的相对调控。本研究中，在正畸牙移动模型中发现抑制STAT3 激活导致骨量降低。文献表明，在人类个体中，STAT3 功能丧失突变导致高免疫球蛋白E 综合征（hyper-immunoglobulin E syndrome，HIES），其体征包括骨质疏松及复发性微小骨折，也提示STAT3 与骨量呈正相关［15］。然而在骨关节炎等病理性情况下，STAT3被过度激活，破骨活动亢进，此时抑制STAT3 激活则削弱破骨活动，引起骨密度的增加［16］，与本研究涉及的生理性牙移动模型有所区别。这提示STAT3 在不同的生理、病理性骨代谢过程中发挥不同作用。

本研究的共培养体系中，没有添加外源性RANKL 促进破骨前体细胞分化，破骨细胞细胞分化依赖于成骨前体细胞所分泌的RANKL。共培养结果表明，抑制STAT3 激活对成骨和破骨分化均有抑制，与原有研究一致［2］。在成骨细胞中，抑制STAT3 提高RANKL/OPG mRNA 比值，促进破骨分化，而在共培养体系中的宏观表现为破骨分化受抑制，提示STAT3 抑制剂可能作用于破骨细胞本身抑制其破骨分化。

在体内实验中，正常大鼠牙移动第7 天时破骨活跃、成骨活动较弱［17］。本实验STAT3 抑制剂使牙移动速率下降，结合本研究体外实验结果，推测STAT3 抑制剂可能通过抑制破骨活动降低了牙移动速率。正常大鼠在牙移动第14 天时，成骨活动达到高峰，而破骨活动有所减缓，牙移动处于缓慢期［17］。Micro-CT 结果显示，实验组骨质较为疏松，说明STAT3 抑制剂可能抑制了成骨活动，使得实验组与对照组相比，牙移动阻力减小，在7～14 d 牙移动速率加快，到第14天时牙移动量和对照组相比没有明显差异。实验组在破骨活动受抑制的情况下，骨量呈减少趋势，说明STAT3 对成骨活动调控的作用更强，STAT3的激活状态与骨量呈正相关。

本实验通过STAT3 功能抑制实验初步证实了STAT3 在正常大鼠正畸牙移动中对牙移动速率和牙槽骨骨量可能发挥正向调控的作用。未来需要开展更多的研究以深入阐明STAT3 在不同生理、病理状态下对牙槽骨塑建及骨稳态的调控作用。