定量检测4 种清热解毒类中药注射液中细菌内毒素的试验方法

张旭，郝欣岭，程晓岭

（神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430）

0 引言

目前，细菌内毒素检查（BET）法应用在注射剂新药品品种的临床研究较多但是使用BET 法的药品大部分是西药，未见静脉中药或者中草药注射剂，且相关的临床研究较少，且发展局处于摸索阶段[1]。中草药静脉注射剂制备过程较为复杂且中药材的来源不等，容易引起热原，中国药典与各种药品标准中针对中草药静脉注射剂无详细的规定热原检查项目，之前使用的家兔检查法成本高且费时，过程繁琐，准确性低，标准化差，大部分制药厂及医院均无此项检查，进而为临床用药造成较大的安全隐患[2]。基于上述背景，本次研究就定量检测4 种清热解毒类中药注射液中细菌内毒素的试验方法展开分析，阐述如下。

1 材料与仪器

1.1 所选仪器。赛默飞世尔科技公司提供的FC 型内毒素仪，湛江安度斯生物有限公司提供的生物探针；津药典标准仪器厂提供的涡旋振荡混合器。

1.2 所选药品及试剂。4 种药品包括清开灵注射液、复方半边莲注射液、茵栀黄注射液及双黄连注射液。细菌内毒素标准品、检查水、检查反应板等。

1.3 检测方法

1.3.1 标准曲线的可靠性试验：依据2015 版《中国药典》中的方法展开各项操作：取1 支CSE，加入800μLBET 水，振荡15 分钟取适量后采用BET 水进行稀释，即为3 个浓度1.0、0.1、0.01 EU/ mL 等，同时需要设定对应的阴性对照管。同时需要另外取得KCA（动态显色法）试剂，加入BET 水，准确测量0.35 mL，使得样品能够得到充分的溶解，最终取得上述CSE 系列浓度溶液25μL，置入反应板上面，之后借助KCA 进行测定，测定吸光度值后绘制对应的标准曲线图，得出相关性系数，即为r。

1.3.2 干扰试验（供试品）：供试品溶液的稀释倍数不能大于最大稀释倍数，随后将4 个样品的溶液浓度分别记录为G1、G2、G3 及G4。

1.4 供试品细菌内毒素限值。细菌内毒素限值的测定公式即为L=K/M，其中K 即为每人每kg 体质量在1h 内可耐受的细菌内毒素剂量最大值。按照2015 年《中国药典》中的规定 得出，因为药物选用的途径差异，为积极保证药物安全性，L 值即为所得出的计算值的二分之一到三分之一。其中清开灵注射液的L=2.0 EU/ mL，复方半边莲注射液的L=5.0 EU/ mL，茵栀黄注射液的L=3.0 EU/ mL，双黄连注射液的L=1.0 EU/ mL。

2 结果

2.1 4 种清热解毒类中药注射液的细菌内毒素限值。依据公式L=K/M 得出，具体结果表1 所述。

表1 4 种清热解毒类中药注射液的细菌内毒素限值

2.2 4 种清热解毒类中药注射液使用KCA 检测的干扰试验结果，见表2。

表2 KCA 检测的干扰试验结果

2.3 回收率。经过KCA 检测之后，得出各供试品溶液与细菌内毒素量的平均回收率为120%。参考标准曲线得出的回归方程得出各供试品溶液与细菌内毒素量，同时测定回收率（R），若无干扰浓度，且回收率即为50%-200%以内，证实KCA 的检测效果好。

3 讨论

中药注射液的成分相对复杂，且颜色比较深，大量研究表明，体外检测方法针对部分中药注射液品种不适用，或者均是检测方法十分的复杂，需要多种试剂方可完成试验。中草药注射剂的均需要进行提取、精制，且工艺相对复杂，流程较长，容易引入一定量的热原，中国药典1995 年版中针对各种药品标准尤其是小针剂中草药注射剂未作出准确的热原检查项，部分品种即便能够进行热原检查项，但是均使用的是家兔检查法，费用成本较高，且整个操作的时间较长，步骤十分的繁琐，试验结果的准确性较差，不能够做到标准化，大部分制药厂及医院均无开展此检查[3]。

确定细菌内毒素限值主要是为了保证被检物品安全性，同时也是为了判断产品是否合格，因此，准确计算细菌内毒素限值对用药安全具有积极的意义。但是，家兔剂量相对于人用最大剂量高10 倍，若按照家兔剂量得出细菌内毒素限值，必然会损失大量的产品内毒素，且操作要求特别严格，导致大部分合格产品最终被判断为不合格，同时也会增加药品生产成本[4]。

通过查阅文献得出，FDA 标准从1993 年开始借助人用最大剂量得出细菌内毒素限值。干扰初筛试验作为一种预试验，主要目的是为了评价样品浓度针对TAL 和内毒素凝集反应之间的干扰程度和干扰性质，初步筛选后检查样品浓度范围是否被干扰，进一步分析相应TAL 灵敏度的干扰情况，进而为干扰试验提供一定的参考依据，避免造成TAL 的大量损失[5]。动态显色法的反应时间对数和细菌内毒素浓度对数呈现一定的反比关系，是一种内毒素定量检测的体外分析试验。该方法检测灵敏度相对较高，且检测范围较宽，结果相对准确[6-7]。相对于家兔法具有较为明显的优势。源于家兔法在进行清热解毒类中药注射剂的热原检查时因为药物自身的清热作用会造成结果的假阴性，加上药物清热作用会导致家兔热原反应的体温逐渐升高，进而使得试验结果造成一定的影响，假阴性的几率明显升高，导致清热解毒类中药注射剂的用药安全受到不同程度的影响[8-10]。

综合上述研究显示，使用动态显色法可对进一步检测4种中药注射液中的细菌内毒素，且干扰试验结果稳定可靠，操作简单方便，干扰回收率高，值得实验室深究。