石斑鱼鱼鳞卵磷脂的提取工艺及抗氧化活性研究

张艳军，王 芸，李 根，黄恩交，蒋 婷，韦晓娜，庞小斌

(北部湾大学石油与化工学院，广西 钦州 535000)

卵磷脂是能够促进身体各细胞正常新陈代谢的重要活性物质，与蛋白质、维生素并称为“第三营养素”[1]，被广泛用于食品、医药、畜牧业等行业[2-4]。目前卵磷脂主要从大豆、蛋黄中提取获得[5-6]。

石斑鱼(Epinephelus spp.)属鮨科(Serranidae)石斑鱼 (Epinephelussp)属，为海产鱼类，广西钦州的四大名贵海产之一[7]。广西北部湾海域自然条件得天独厚，鱼类资源尤为丰富[8]，每年在鱼类加工生产环节会产生大量的鱼鳞，其中海鱼类鱼鳞中富含卵磷脂[9]。

本实验以石斑鱼鱼鳞为原料，依据卵磷脂的特性，改良有机溶剂萃取法，通过单因素实验和正交实验，对卵磷脂的提取工艺进行研究，并探讨其抗氧化活性。此研究可为海洋废弃物资源鱼鳞的再利用提供科学的理论依据。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

仪器：UV-2600紫外可见分光光度计，JY92-IIDN超声波细胞粉碎机，ATY124分析天平，SHZD(III) 循环水式多用真空泵。

试剂：卵磷脂标准品(＞98%)，丙酮、无水乙醇、盐酸(均为分析纯)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验原理

1)卵磷脂的提取测定。依据卵磷脂难溶于丙酮的特性，先用丙酮浸泡鱼鳞，将鱼鳞中的一些非目标提取物杂质清除；依据卵磷脂易溶于乙醇的特性，用乙醇进行提取；最后利用紫外分光度法来测定。

2)卵磷脂对羟基自由基清除率的测定。人体内的自由基产生过多或清除能力下降时，会导致各种病变，因此清除过量的自由基具有重要的生理意义。羟自由基 (OH·)是较强的氧化剂，反应性极强，寿命极短，几乎可以和所有细胞成分发生反应，对人体危害极大[10]。因此羟自由基的清除率是反映物质抗氧化能力的重要指标。以从石斑鱼鱼鳞中提取的卵磷脂为原料，从清除羟自由基的角度研究鱼卵磷脂的体外抗氧化活性。

1.2.2 原料处理

取自北部湾的石斑鱼鱼鳞，洗净、烘干、粉碎，干燥，用密封袋储藏于干燥器中备用。

1.2.3 实验设计

1)石斑鱼鱼鳞的预处理。取一定量的鱼鳞粉置于烧杯中，用适量的0.4mol·L-1的HCl浸泡除去钙离子。抽滤后用适量丙酮浸泡除杂，减压过滤后，用一定浓度的乙醇进行提取。

2)提取工艺优化。考察乙醇浓度、固液比、超声提取功率、超声提取时间等对鱼鳞卵磷脂提取率的影响，以确定单因素提取的最佳条件。在单因素实验的基础上设计正交实验，以确定最优的提取工艺。

1.2.4 卵磷脂标准溶液配制

准确称取0.25g标准卵磷脂，用乙醇溶解后，转移至50mL容量瓶中，定容，配制成5mg·mL-1卵磷脂储备液。

1.2.5 最大吸收波长的确定

用紫外可见分光光度计，在190～500nm范围内对卵磷脂标准品进行光谱扫描，确定最大吸收波长。

1.2.6 卵磷脂标准曲线的建立

取卵磷脂储备液 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mL，分别移入25mL容量瓶，用无水乙醇定容，摇匀，得浓度分别为 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6mg·mL-1的系列溶液。用无水乙醇作为空白试剂组。

1.2.7 鱼鳞卵磷脂提取率的计算

式中：a为提取物中卵磷脂的量，g；A为称取原料的总质量，g。

1.2.8 鱼鳞卵磷脂的抗氧化活性

利用水杨酸法测定鱼鳞卵磷脂对羟基自由基的清除率，参照文献[11]的方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 卵磷脂的最大吸收波长

经紫外光谱扫描，确定卵磷脂的最大吸收波长为 215nm (图 1）。

图1 卵磷脂标准液的光谱扫描图

2.2 卵磷脂标准曲线的绘制

如图2所示，以样品浓度(X)为横坐标，吸光值(Y)为纵坐标，进行线性回归分析，标准曲线为：Y=1.0479X+0.0266，R2=0.9992，卵 磷脂在 0.1～1.6mg·mL-1浓度区间内有良好的线性关系。

图2 卵磷脂的标准曲线图

2.3 鱼鳞卵磷脂提取工艺的确定

2.3.1 乙醇浓度对卵磷脂提取率的影响

设定固液比为1∶40，超声功率为150W，超声时间4min，溶剂乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%进行实验，考察乙醇浓度对卵磷脂提取率的影响。结果见图3。由图3可知，随着乙醇浓度增加，卵磷脂的提取率有明显提高，溶剂乙醇浓度为60%时，卵磷脂提取率达到最大；溶剂乙醇浓度大于60%后，卵磷脂提取率反而减小。卵磷脂是偏弱极性，根据极性相似相溶原理，随着溶剂乙醇浓度的提高，提取率会降低。因此，60%是最佳乙醇浓度，此时卵磷脂提取率可达3.77%。

图3 溶剂浓度对卵磷脂提取率的影响

2.3.2 固液比对卵磷脂提取率的影响

用60%乙醇提取，超声4min，超声功率150W，设定固液比分别为 1∶15、1∶25、1∶35、1∶45、1∶55，考察固液比对卵磷脂提取率的影响，结果见图4。由图4可知，卵磷脂的提取率随固液比的增大而提高。固液比达到1∶25时，提取率达到最大，继续增加固液比，提取率有明显的下降趋势。因此选择固液比为1∶25，此时提取率可达4.15%。

图4 固液比对卵磷脂提取率的影响

2.3.3 超声功率对卵磷脂提取率的影响

乙醇浓度60%，固液比1∶25，提取时间4min。超声功率分别设定为 120、150、180、210、240W，考察超声提取功率对卵磷脂提取率的影响，结果见图5。由图5可知，卵磷脂提取率随超声提取功率的增大而提高，功率为210W时，卵磷脂提取率达到最大。这是由于超声功率增大，超声波对鱼鳞细胞的破碎作用增大，分子运动加剧，溶出物增多，卵磷脂提取率也增高。超声功率超过210W后，卵磷脂提取率下降，这是因为超声功率的不断增加，会导致提取溶剂的温度快速升高，造成部分卵磷脂因温度过高而发生分解，卵磷脂的提取率下降。因此，超声提取功率以210W为最佳，此时提取率可达4.62%。

图5 超声提取功率对卵磷脂提取率的影响

2.3.4 超声时间对卵磷脂提取率的影响

乙醇浓度为60%，固液比为1∶25，提取温度25℃，超声提取时间分别设定为 4、8、12、16、20min，考察超声提取时间对卵磷脂提取率的影响，结果见图6。从图6可知，随着超声提取时间延长，卵磷脂的提取率也随之提高，超声提取时间为8min时提取率达到最大，超过8min后，卵磷脂提取率有明显的下降。因此超声时间以8min为宜，此时提取率可达4.98%。

图6 超声提取时间对卵磷脂提取率的影响

2.3.5 正交实验

根据鱼鳞卵磷脂提取的单因素实验结果，以乙醇浓度、固液比、超声功率、超声时间为影响因素，在单因素实验的基础上，采用L9(34)正交实验表进行实验，得出卵磷脂的最佳提取工艺参数。正交实验设计表及正交实验结果见表1、2。

表1 L9(34)正交实验设计表

表2 L9(34)正交实验结果与分析

由表2可知，影响石斑鱼鱼鳞卵磷脂提取率的各因素的极差大小为A＞D＞C＞B，即乙醇浓度的影响最大，其次是超声提取时间和超声功率，固液比的影响最小。确定的最佳提取工艺条件为A2B2C2D2，即乙醇浓度为60%、固液比为1∶25、超声功率为210W、超声时间8min。在最佳提取工艺下，卵磷脂的提取率达到4.98%。

2.4 卵磷脂的体外抗氧化活性

称取适量鱼鳞经预处理后，按最佳提取条件对鱼鳞卵磷脂进行提取。将得到的样品分别配制成不同的浓度梯度 (1、2、4、6、8mg·mL-1)，按 1.2.8的方法测定抗氧化活性，以无水乙醇为空白对照，结果见图7。由图7可知，卵磷脂对·OH清除率呈现剂量依赖性，清除率曲线为：y=7.686x+14.75，R2=0.9967，在1.0～8.0 mg·mL-1浓度范围内线性关系良好。计算得到的鱼鳞卵磷脂对·OH的IC50为4.59mg·mL-1。

图7 鱼鳞卵磷脂对·OH自由基的清除能力

3 结论

本实验以石斑鱼鱼鳞为原料，采用有机溶剂及超声辅助提取，通过单因素实验，研究乙醇浓度、固液比、超声功率、超声时间等因素对鱼鳞卵磷脂提取率的影响。采用正交实验法L9(34)优化提取石斑鱼鳞卵磷脂的提取工艺，以羟自由基的清除率为指标，研究了鱼鳞卵磷脂的体外抗氧化活性。实验结果表明，最佳的提取工艺条件为：乙醇浓度60%、固液比1∶25、超声提取功率210W、超声提取时间8min。该条件下，卵磷脂的提取率达到4.98%。石斑鱼鱼鳞卵磷脂清除羟自由基的半抑制浓度 (IC50)为4.59 mg·mL-1，具有较好的体外抗氧化活性。实验结果可为废弃鱼鳞的进一步开发提供一定的数据支撑。