TGF-β1参与调控LMP1介导信号转导通路研究

姚晓媛，宋晓环，王忠超，钟志伟

(长春医学高等专科学校，长春 130031)

EB病毒(EBV)不仅是单核细胞增多症的一个病原体，也是一个比较重要的DNA肿瘤病毒，与T/B淋巴细胞瘤、何杰金病以及鼻咽癌等多种肿瘤的发生和发展有关。而潜伏膜蛋白1(LMP1)作为EBV的一个致瘤蛋白，能够在体外向成纤维细胞转化，具有抑制细胞分化、细胞凋亡以及介导细胞增殖的功能，与NPC低分化有关，并且可以对肿瘤的转移和侵袭起到一定的促进作用[1]。而转化生长因子-β1(TGF-β1)可以调控细胞的分化和生长，并且肿瘤的发生和发展与其传导紊乱和表达异常有关。本研究对LMP1介导信号转导通路中TGF-β1的参与作用进行了研究，报告如下。

1 材料和方法

1.1 细胞系

本研究细胞系包括HCG-27和SCG-7901为EBV阴性胃癌细胞系、SNU719阳性胃癌细胞系。其中，培养液为链霉素100 mg/L、青霉素100 kU/L以及胎牛血清，并且按照常规方法培养细胞。

1.2 主要试剂

研究试剂包括TGF-β1、逆转录试剂盒、脂质体转染试剂以及RNA提取试剂。

1.3 方法

1.3.1 siRNA649转染

GT38为表达LMP1的EVB阳性细胞系分为5组，分别是TGF-β1处理组、siRNA649+TGF-β1处理组、siRNA649处理组、Lip2000对照组以及细胞对照组。其中，TGF-β1处理组运用70%～80%细胞汇合度的单层细胞，将培养液去掉后，运用PBS液进行2次洗涤，然后将DMEM培养液加入继续培养。而siRNA649处理组转染前1 d，运用无抗生素培养基对GT38细胞进行培养，待细胞汇合度为30%～50%时，运用脂质体法以50 nmol/L的浓度将特异性siRNA649转染为GT38细胞。同时，TGF-β1+siRNA649处理组转染后，将浓度为10 mg/L的TGF-β1加入进行处理。上述各组经过48 h作用后，将培养液弃去，运用胰蛋白酶对细胞进行收集，运用PBS对细胞进行2次洗涤，并运用TRIzol一步法对细胞总RNA进行提取。

1.3.2 检测转录水平

选择细胞总RNA为模板，根据逆转录试剂盒要求，将cDNA合成进行PCR扩增，根据参照文献设计内参照基因GAPDH、LCAM-1、EGFR、CDK4、Survivin、MMP9以及LMP1的引物，并且运用凝胶成像系统对电泳结果进行分析。

2 结果

2.1 siRNA649转染后LMP1 mRNA的转录表达

采用50 nmol/L终浓度siRNA649对GT38细胞进行转染，待48 h后，对各组细胞总RNA进行提取，并运用RT-PCR对LMP1 mPRN转录表达进行检测。结果显示，LMP1 mRNA转染后表达缺失，见图1。

2.2 TGF-β1对不同因子转录表达的影响

TGF-β1作用HCG-27、SGC7901、SNU719以及GT38细胞系48 h后，GT38细胞系ICAM-1的表达明显低于对照组(P<0.05)，但是在其他细胞中表达比较无差异(P>0.05)。同时，TGF-β1作用前后，4种细胞系的表达对比无统计意义(P>0.05)，见表1。

图1 RT-PCR检测的转录表达

表1 各组的转录表达灰度值

3 讨论

EBV作为人类的一个肿瘤病毒，其与上皮细胞和淋巴细胞源性肿瘤的发生有关，而LMP1编码基因作为公认的一个病毒癌基因。本研究发现，在EBVaGC的发生和发展中，LMP1发挥着极其重要的作用。MMPs作为ECM降解的一个重要酶类，多种恶性肿瘤的转移与其过度表达有关，并且在上皮细胞中，LMP1能够对MMP9表达发挥一定的诱导作用[2]。Survivin作为凋亡抑制的一种蛋白，可以促进细胞增殖，对细胞凋亡进行抑制，调节细胞有丝分裂，并且对肿瘤转移和生长起到一定的促进作用[3]。本研究发现，升高CDK4 mRNA表达后，可下调Survivin转录表达，并且LMPI能够利用AP-1信号转导通路对Survivin表达进行调节，从而参与EBV相关肿瘤的发生和发展。同时，LMP1能够活化NF-κB和磷酸化ERK1/2，对TGF-β1调控生长进行抑制，并且TGF-β1对GT38细胞系产生直接作用后，还能明显降低ICAM-1表达。

综上所述，LMP1沉默后能够对ICAM-1、Survivin以及MMP9表达进行抑制，有助于CDK4表达，并且LMP1与TGF-β1参与介导的ICAM-1表达有关。