山苍子果实发育及内含物、精油的变化规律

蓝公毅，陈景震，马英姿，刘 熙，周诗雨

（1.中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004；2.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004）

山苍子Litsea cubeba又名山鸡椒、木姜子等，为樟科落叶灌木或小乔木，在我国分布于长江以南，广西、广东、湖南、贵州、四川等省区，以野生为主，生长于低山丘陵地区[1]。山苍子果实、花、叶、根都是提取山苍子油的原料，果实含油率最高[2-5]，其精油中的主要成分是柠檬醛，为制造紫罗兰酮系列香料的重要原料。目前山苍子精油在食品、医药、农药、洗涤、化妆品等领域均有广泛应用[6-15]。

近年来植物精油的医学作用逐渐成为研究热点，刘威等[16]研究发现，臭冷杉精油具有显著抗炎作用，能够有效镇咳、祛痰，并且对乙酰胆碱和磷酸组胺喷雾引起的豚鼠哮喘有明显抑制作用；权美平等[17]研究发现，茜草精油对四氯化碳导致的肝损伤有保肝作用；扶巧梅等[18]研究发现，雪松叶精油和马尾松叶精油对白纹伊蚊和致倦库蚊有较强的毒杀活性；有研究表明山苍子精油具有祛风散寒、理气止痛、健胃消食等功效[19]， 临床用精油治疗慢性气管炎，支气管哮喘，冠心病及心绞痛等[20-22]；山苍子精油还可用于降解致癌物质黄曲霉素，对于粮食污染有奇特功效[23]， 同时，山苍子精油对副溶血性弧菌菌Vibrio parahaemolyticus、李斯特菌Listeria monocytogenes和植物乳杆菌Lactobacillus plantarum有着显著的抑制作用[24]，可以抑制菌丝生长并且改变其超微结构，被认为是一种安全的天然植物保护剂。

目前国际市场的山苍子油价格持续升高，在2008年底，柠檬醛含量达到70%以上的山苍子精油价格可达1.0×105元·t-1，而我国年产的山苍子油有20 000 t 以上，是世界上最大的山苍子油生产国和出口国，年出口量达3 500 t，产品远销海 外[26-28]，另一方面，我国山苍子产量虽高，但生产水平偏低，出口以初级原油为主，无法将我国山苍子资源优势利用充分。本研究对山苍子果实的生长发育动态、内含物含量、精油含量、精油组分进行了研究，旨在为山苍子果实精油的更好利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试 剂

蔗糖、蒽酮、乙酸乙酯、98% 浓硫酸、80%Ca(NO3)2、NI2-NI、100 μg·mL-1标准蛋白溶液、考马斯亮蓝G-250、正己烷、氢氧化钠、甲醇、无水硫酸钠均为分析纯。

1.2 材 料

试验材料采集于湖南省林科院试验林场，选择生长良好的植株，从果实形成（4月31 日）开始，在5—9月，共计110 d，采用随机取样法，每7 ～ 10 d 采样一次，每次采果实100 粒，采后立即置入保鲜袋带回实验室，储存在-4 ℃冰箱中备用。

1.3 方 法

1.3.1 果实生长变化的测量

在不同时间随机选取发育正常的山苍子果实20 颗，用电子数显游标卡尺测量其横、纵径，记录测量结果；用电子天平测定百粒果实的鲜质量（精确度1/1 000）。

1.3.2 果实内含物含量测定

果实可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法；蛋白质含量测定采取考马斯亮蓝G-250 法；淀粉含量测定参考苗红霞[29]的试验方法，对山苍子果实中淀粉总含量进行测定，将山苍子果实浸入0.5%的亚硫酸氢钠溶液中护色10 min，于40 ℃干燥20 ～24 h，磨粉，水洗后进行离心，其残渣用 5 mL 80%Ca(NO3)2悬浮，沸水浴提取10 min，在4 000 r·min-1下离心4 min，将上清液转入20 mL 容量瓶，残渣用80%Ca(NO3)2重复提取2 次，用提取液定容至20 mL，实验设3 次重复，显色方法参考徐昌杰等[30]的报道。取样品1 mL，用80%Ca(NO3)2补充至2 mL,加入100 μL NI2-NI，摇匀，在620 nm 波长下测定吸光度，计算样品中淀粉含量。

1.3.3 果实精油含量测定

自5月开始，每月从山苍子植株上采集鲜果，取粉碎后的果实100 g，置于旋转蒸发器中，采用水蒸馏法提取精油，计算精油含量。

1.3.4 精油组分测定

精油甲酯化：取50 μL 油样置于试管，加入4 mL 正己烷溶解油样，再加2 mL NaOH-甲醇溶液，震荡，在50 ℃水浴锅中水浴10 min，加2 mL 蒸馏水，摇匀后取上清液置于离心管，加入无水Na2SO4，移50 μL 置于浸样瓶，加入正己烷待测。

采用气相色谱法测定，色谱柱为FFAP 型，石英玻璃毛细管柱（0.3 mm×25 m），升温程序：柱温从40 ℃保持1 min、以20 ℃·min-1的速度升温至100 ℃，保持2 min；再以20 ℃·min-1升温至 220 ℃，保持2 min；最后以20 ℃·min-1升温至 280 ℃，保持5 min。色谱参数：载气为高纯度氦，总流速40 mL·min-1，柱内流速1.1 mL·min-1，进样口温度250 ℃，进样量1 μL。GC 和MS 接口温度270 ℃，质谱条件：电子轰击能量70 eV，离子源温度230 ℃，扫描质量范围（m/z）15 ～ 500 amu。色谱图结果按照峰面积归一法计算。

1.4 数据处理

运用SPSS17.0 软件进行数据统计与分析，运用OriginPro2017 软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 山苍子果实发育的动态变化

2.1.1 山苍子果实的外部形态变化

山苍子果实的横、纵经在生长发育过程中呈现为较明显的“S”型曲线趋势（图1）。不同生长时期果实的横径与纵径生长变化的趋势相对一致，其具体生长过程可划分为3 个时期：1 ～25 d，幼果的横纵径快速增长，是果实发育全时段中生长最迅速的时期，果实横、纵径分别增长2.41、1.78 mm，纵径生长量达到了果径增长总量的45%左右，果皮呈翠绿色；25 ～80 d， 果实增长速度趋于平缓，横、纵经分别增长1.61、1.78 mm，此阶段的增长量为果径总增长量的35%左右，这一阶段果实表皮上开始出现白色斑点，绿色逐渐加深；80 ～110 d，果实生长的第二次高峰期，横、纵径分别增长0.88、 0.76 mm，横纵径增长量达到果径总增长量的20%左右，在这一阶段的后期，果实开始变黑，步入成熟期，增长速度减缓，最终停止增长。横纵径的变化幅度在发育过程中基本保持同步变化。

进入9月以后，在果实发育的110 ～130 d，山苍子果实失水皱缩，果径开始迅速下降，果实横径下降1.43 mm，纵径下降1.32 mm，分别占完熟期果实横、纵径的20.4%和18.1%。

图1 山苍子果实形态动态变化Fig.1 Dynamic change of fruit morphology in L.cubeba

2.1.2 山苍子果实的质量增长变化

山苍子果实千粒质量的增长动态也呈现出较为明显的“S”型曲线生长趋势（图2）。但生长趋势与果实横、纵径的生长变化相反，其生长同样可以划分为3 个时期：1 ～40 d，果实千粒质量增长较为缓慢，此阶段果实千粒质量增长46.2 g，增长量达到增长总量的33%左右；40 ～80 d 果实发育较为迅速，果实千粒质量增长72.2 g，增长量达到增长总量的52%左右；80 ～110 d，果实发育速度再次变得缓慢，在此阶段中，千粒质量增长量为20.5 g，达到增长总量的15%左右。

进入9月以后，在果实发育的110 ～130 d，山苍子果实失水皱缩，果实千粒质量开始迅速下降，千粒质量下降22.8 g，占完熟期果实千粒质量的14.3%。

图2 山苍子果实千粒质量动态变化Fig.2 Dynamic change of 1 000-fruit mass in L.cubeba

以果实发育时间作为自变量，果实横纵经、千粒质量分别作为因变量求得相关系数R² （R2横径=0.912，R2纵径=0.935，R2千粒质量=0.834），可以看出，山苍子果实的发育形态与果实发育的时间高度相关。

2.2 果实内含物含量的变化

2.2.1 果实发育过程中可溶性糖含量变化

果实可溶性糖含量在发育前期呈现下降趋势（图3），在14.0 ～8.9 mg·g-1之间，随后在发育中期回升至初期水平，在8.9 ～11.9 mg·g-1，在发育后期趋于稳定略有上升，在11.9 ～14.8 mg·g-1之间，完熟期达到峰值，在果实完全成熟后含量因自身消耗开始下降。

2.2.2 果实发育过程中淀粉含量变化

果实淀粉含量与可溶性糖含量变化方式相似，在发育前期呈现下降趋势，在13.6 ～8.0 mg·g-1之间，中期开始回升，在8.0 ～10.4 mg·g-1之间， 后期趋于稳定且有缓慢上升，在10.4 ～12.9 mg·g-1之间，果实完全成熟后含量开始下降。

2.2.3 果实发育过程中可溶性蛋白含量变化

果实的可溶性蛋白含量在发育前期迅速增加，随后又下降至初期水平，在13.5 ～13.4 mg·g-1， 其中最高达到17.0 mg·g-1，中期开始下降，在13.4 ～10.1 mg·g-1，发育后期迅速上升10.1 ～ 26.2 mg·g-1，完熟期达到峰值，随后因果实自身消 耗，含量开始迅速下降。

2.3 山苍子果实形态变化与内含物含量变化的相关性

山苍子果实内含物积累与外部形态发育及精油积累相关性分析（表1）显示：在山苍子果实发育过程中，可溶性糖和淀粉与果实外部形态变化及精油积累不具备明显相关性，而蛋白质含量则具有明显的相关性，蛋白质含量与果实干质量（r=0.778）和果实精油含量（r=0.728）存在相关性，可见，山苍子果实蛋白质的含量在果实发育过程中伴随果实质量和精油含量的升高，呈明显上升趋势。山苍子在发育过程90 ～110 d 时，淀粉和可溶性糖含量没有出现明显变化，蛋白质含量则显著下降，此阶段为山苍子果实精油迅速积累期，推测可能是蛋白质在此阶段大量转化为油脂导致。

图3 山苍子果实的内含物含量变化Fig.3 Changes of inclusion contents in L.cubeba fruit

表1 果实内含物含量与外部形态及精油积累相关性分析Ta ble 1 Analysis of correlation of contents of inclusions in fruit with external morphology and accumulation of essential oil

2.4 果实精油含量的变化

采用水蒸馏法，测得山苍子果实的精油含量从5—9月分别为1.89%、2.96%、4.02%、4.97%、3.64%。在果实发育初期，采用常规方法检测不到果实精油的存在。

从5月份开始，果实质量体积方面的增长处在相对缓慢的阶段，在此时，精油含量快速增长，即果实正在快速积累油脂，并在8月达到最高，为4.97%。

8月下旬果实完全成熟，大小形态几乎不再变化，颜色由绿色开始变黑，逐渐开始失水变小，9月精油含量已经降低至3.64%。表明在8月中旬果实成熟时，可以开始采收。

2.5 不同时期山苍子果实精油成分的变化

经过对山苍子果实精油的分析鉴定，共检测出20 种成分（表2），其中5—9月分别检测出19、20、20、17、16 种。

表2 5—9月山苍子果实精油化学成分及含量†Table 2 Chemical components and their contents in L.cubeba essential oil from May to September

山苍子果实在发育过程中的主要成分为D-柠檬烯、桉叶油醇、马鞭草烯醇、橙花醛、香叶醛，其变化规律如图4 所示。随着果实发育成熟，柠檬醛的两种异构体橙花醛和香叶醛的含量有明显升高，在5月含量分别为12.05%、17.44%，到9月果实完全成熟后含量分别达到31.14%、40.49%，成为果实精油中含量最多的成分；D-柠檬烯的含量随着果实发育，则呈现明显的下降趋势，在5月，含量高达39.92%，是此时果实中含量最高的成分，在9月其含量已下降至2.31%；桉叶油醇在5月含量为11.40%，在9月含量仅存0.73%；马鞭草烯醇在果实发育过中较平稳，仅在6月上升至14.13%，其余月份基本保持稳定，果实完全成熟时含量为8.60%。研究中发现，在7—8月，即果实发育的90 ～120 d，各主要组分含量无论处于上升还是下降趋势，在此时期都保持较稳定水平，其具体机制有待进一步研究。最重要的有效成分柠檬醛在果实成熟后含量仍然有提升，但受限于果实在发育150 d 时已完全成熟，其后精油含量明显下降的原因，可确定最佳的采收日期为8月下旬。

图4 山苍子果实精油主要成分动态变化Fig.4 Dynamic changes of main components in L.cubeba fruit essential oil

在其它组分中，随着果实发育，含量有明显上升趋势的组分有双戊烯、2,4-二甲基庚烷、4-甲基辛烷、香茅醇、α-蒈烯、庚三醇（在5月份尚未检测出该组分）；含量有明显下降趋势的组分有α-松油醇、香叶醇（8、9月已检测不到该组分）、α-水芹烯（8、9月已检测不到该组分）、芳樟醇、1,3,8-孟三烯（在8、9月已检测不到该组分）； 7月含量达到最高值的组分有：月桂烯、甲基庚烯酮、反石竹烯。

2.6 山苍子果实形态变化与精油成分变化的相关性

山苍子果实外部形态变化与精油主要成分变化相关性分析（表3）显示：除马鞭草烯醇外，其它的主要组分与外部形态存在显著的相关性。D-柠檬烯与果实千粒质量（r=-0.903**）呈极显著负相关，与果实大小（与横径r=-0.801*，与纵径r= -0.816*）呈显著负相关；桉叶油醇与果实千粒质量（r=-0.948**）呈极显著负相关，与果实大小（与横径r=-0.881*，与纵径r=-0.894*）呈显著负相关；橙花醛与果实千粒质量（r=0.880*）呈显著正相关，与果实大小（与横径r=0.784，与纵径r=0.794）呈显著正相关；香叶醛与果实千粒质量（r=0.830*）呈显著正相关，与果实大小（与横径r=0.739，与纵径r=0.741）呈显著正相关，表明随着果实发育成熟，D-柠檬烯和桉叶油醇含量减少，橙花醛和香叶醛含量升高。

在精油含量方面，精油含量与果实千粒质量（r=0.961**）呈极显著正相关，与果实大小（与横径r=0.966**，与纵径r=0.977**）同样呈极显著正相关，表明果实生长过程中外部形态指标与精油含量有非常明显的关联，其中关联系数最大的是果实纵径，表明果实纵径基本可以指示果实精油含量的变化。

综上所述，经过对果实外部形态与精油含量及成分的相关性分析，发现果实外部形态与精油含量都具有一定的相关性，其中与精油积累关联最大的是千粒质量，则表明千粒质量基本可以指示果实精油含量及成分的变化，可以此对发育中的果实精油积累情况进行监测，确定果实的发育状况，制定合理的采收时间。

表3 山苍子果实精油与外部形态相关性分析†Table 3 Correlation analysis between components in essential oil and external morphology in L.cubeba fruit

3 结论与讨论

山苍子果实发育从花后10 d 开始，具体时间为4月中下旬至9月上旬，持续时间110 d，根据果实发育的外部形态特点，可以将果实发育划分为3 个时期：果实快速生长期（花后10 ～35 d）， 果实缓慢生长期（花后35 ～90 d），果实颜色变化期（花后90 ～130 d）。果实可溶性糖及淀粉的含量经过发育初期的下降逐渐回升到初始浓度水平，可溶性糖含量在花后105 d 时达到最高，为14.77 mg·g-1，淀粉含量在花后105 d 达到最高，为12.87 mg·g-1，蛋白质含量此时同样达到最高值26.81 mg·g-1，表明果实内含物合成的高峰期主要集中在花后50 ～100 d 之间，即6月下旬到8月上旬之间。在这一阶段中，果实含水率下降迅速，这可能是由于果实发育过程中，内含物及精油的不断积累导致含水率不断下降，这与汤佳[31]、郑德勇[32]的研究结果一致。能够引起果实膨大、鲜质量增高的原因主要分为果实细胞数量增加、果实细胞体积增大、果实细胞的间隙增大[33]。在本研究中，花后约90 d 之后，可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白3 种内含物含量均出现下降，此时果实的横纵经、千粒质量处在增加的末期，在此阶段之后，外部形态指标开始降低，表明在果实膨大、鲜质量增高的阶段需要充分的营养供应，推测花后约90 d 内含物含量下降是由于果实膨大消耗养分导致。在果实进入颜色变化期后，果实精油含量则迅速积累，蛋白质含量则明显下降，根据内含物含量与精油含量的相关性分析，蛋白质可能在此阶段大量转化为油脂，其具体转化机制目前有待进一步研究。

在果实精油含量方面，可以发现山苍子果实的精油含量随着发育时间的增长呈现线性增长，但在果实发育成熟后精油开始挥发，总含量下降；5—9月精油中共检测出20 种成分，其中5—9月分别检测出19、20、20、17、16 种，5—9月均有出现的成分有15 种，精油中的主要成分为：D-柠檬烯、桉叶油醇、马鞭草烯醇、橙花醛、香叶醛。D-柠檬烯及桉叶油醇含量伴随果实发育明显下降，橙花醛及香叶醛含量则显著上升，马鞭草烯醇含量变化则没有明显规律，含量保持相对稳定。根据果实外部形态变化与精油主要成分变化相关性分析，精油含量与果实千粒质量呈极显著正相关，与果实大小同样呈极显著正相关，表明果实生长过程中外部形态指标与精油含量有非常明显的关联。在精油的主要成分中，除马鞭草烯醇外，其它的主要组分与外部形态存在显著的相关性。D-柠檬烯与果实千粒质量呈极显著负相关，与果实大小呈显著负相关；桉叶油醇与果实千粒质量呈极显著负相关，与果实大小呈显著负相关；橙花醛与果实千粒质量呈极显著正相关，与果实大小呈显著正相关；香叶醛与果实千粒质量呈显著正相关。在发育过程中，D-柠檬烯含量迅速下降，柠檬醛含量迅速上升，可见在发育过程中D-柠檬烯会转化为柠檬醛，其具体转化机制有待进一步研究。在精油的主要成分中，D-柠檬烯含量随着果实发育明显下降，在5月含量可达总量的40%，D-柠檬烯具有消炎、减痛、抑菌、治疗癌症的作用[34-35]， 如需要提取柠檬烯，可在果实发育初期，即5月14、15 日采收果实。桉叶油醇在5月份含量11.40%，随着发育时间迅速下降，9月含量仅存0.73%，桉叶油醇在临床医学上用于与樟脑组成配方治疗头痛，如需提取桉叶油醇同样可在果实发育初期，即5月14、15 日采收果实。最主要的有效成分柠檬醛（橙花醛+香叶醛）在果实发育初期含量为29.49%（12.05%+17.44%），发育至8月中旬时含量可达57.38%（25.26%+31.82%），9月中旬时含量可达71.63%（31.14%+40.49%），但受限于果实精油总含量在8 中旬后由于完全成熟已经开始明显挥发下降，可确定为获取柠檬醛采收山苍子果实的最佳时期为8月下旬。