加速溶剂萃取-QuEChERS/超高效液相色谱-串联质谱法同时测定药食同源性食品中双酚类化合物

曾 静，曲 栗,2，古淑青*，邓晓军，伊雄海，张 晶，丁 涛，柳 菡

(1.上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135；2.复旦大学 公共卫生学院，上海 200433；3.北京市疾病预防控制中心，北京 100013；4.南京海关动植物与食品检测中心，江苏 南京 210001)

双酚类化合物(BPs)主要有双酚A(BPA)、双酚F(BPF)、双酚S(BPS)、双酚A-二缩水甘油醚(BADGE)及其衍生物、双酚F-二缩水甘油醚(BFDGE)及其衍生物等。由于在生产和生活中的广泛使用，BPs已成为一种环境污染物，在空气、水、土壤和食品中均有检出[1-4]。双酚类化合物通过环境、包装材料及包装器皿等迁移到食品和中药材等产品中，许多国家通过法律法规控制或禁止使用这类物质[5]。我国国家标准规定在食品或食品模拟物中双酚S的迁移量不能超过0.05 mg/kg[6-7]；欧盟法规(EC/1895/2005号指令)规定，自2006年1月1日起在食品接触材料中禁止使用BFDGE，并规定BADGE、双酚A-(2,3-二羟丙基甘油醚)(BADGE-H2O)、双酚A-双(2,3-二羟丙基甘油醚)(BADGE-2H2O)在食品或食品模拟物中的迁移总量不超过9 mg/kg，单一各类在食品或食品模拟物中的迁移量不超过1 mg/kg[8]。近年来，双酚类化合物的测定一直是研究热点。

目前，关于双酚类化合物的研究主要集中于水、土壤、玩具、食品包装材料、罐头食品、婴儿食品中BPA、BPF和BPS的测定[9-12]。食品中双酚类化合物的检测方法主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)、液相色谱-紫外可见光谱法(HPLC-UV)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等，但GC-MS法操作繁琐且耗时长，HPLC-UV法的灵敏度较低。LC-MS/MS法分析时间短且具有较高的灵敏度，被广泛用于食品及食品包装材料中双酚类化合物的定性及定量测定[13-14]。双酚类化合物的萃取方法主要有液-液萃取、固相萃取、超声辅助萃取等，但上述方法耗时长，且目标物易损失[15-19]。加速溶剂萃取(ASE)是近年发展起来的一种萃取技术，在较高压力和温度下，利用一定配比的有机溶剂作为萃取液对样品进行萃取，具有自动化程度高、溶剂用量少、耗时短的特点[20-21]。QuEChERS法由于操作简单，被广泛用于农、兽药残留分析[22]，近年来也被用于双酚类化合物的测定[23]。

药食同源性食品既可作为药物，又可用作食品原料，具有较大的商业价值，但在生产、加工和运输过程中，双酚类化合物可能会经包装材料迁移其中。目前，药食同源性食品的研究主要集中于有效成分分析[24-26]。由于药食同源性食品基质中含有黄酮、氨基酸等化合物，用传统的QuEChERS法提取药食同源性食品中的双酚类化合物回收率较低，而将ASE和QuEChERS联用能大大提高前处理效率和回收率。本实验将ASE与QuEChERS法结合，对药食同源性食品山银花、葛根、沙棘中的双酚类化合物进行提取和净化,采用超高效液相色谱-串联质谱进行测定，尚未见相关文献报道。本方法操作简单、快速，灵敏度高，满足药食同源性食品中双酚类化合物的同时快速检测要求。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Nexera X2液相色谱(日本Shimadzu公司)，QTRAP 6500三重四极杆-线性离子阱质谱仪(美国AB Sciex公司)；Vortex2涡旋混合器(德国IKA公司)；ASE-350加速溶剂萃取仪(美国ThermoFisher公司)；Milli-Q超纯水一体机(美国Millipore公司)；N-EVAP氮吹仪(美国Organomation 公司)；Allegia X-22R高速冷冻离心机(Beckman公司)；0.22 μm有机相滤膜(上海安谱科学仪器有限公司)；R-215旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)。

标准品：双酚A(BPA)、双酚F(BPF)(纯度>95.0%，日本TCI公司)；双酚A-二缩水甘油醚(BADGE)、双酚A-(2,3-二羟丙基甘油醚)(BADGE-H2O)、双酚A-双(2,3-二羟丙基甘油醚)(BADGE-2H2O)、双酚A-(3-氯-2-羟丙基甘油醚)(BADGE-HCl)、双酚A-双(3-氯-2-羟丙基甘油醚)(BADGE-2HCl)、双酚A-(3-氯-2-羟丙基)(2,3-二羟丙基)醚(BADGE-H2O-HCl)、双酚F-双(3-氯-2-羟丙基甘油醚)(BFDGE-2H2O)(纯度>98%，瑞士Fluka公司)；双酚F-二缩水甘油醚(BFDGE)(纯度>95%，德国Dr.Ehrenstorfer公司)；双酚S(BPS)(纯度>99%，美国Admas公司)；双酚A内标(BPA-D16)、双酚S内标(BPS-13C12内标)(纯度>96%，上海市化工研究院)。

甲酸(色谱纯，美国Fluka公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，美国Merck公司)；乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；山银花、葛根、沙棘样品购于各大型超市及药店。

1.2 标准溶液的配制

1.2.1 标准储备液分别准确称取待测11种BPs的标准品10.0 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，分别得到质量浓度为1.0 g/L的标准储备液，于4 ℃下保存。

1.2.2 混合标准储备液分别准确吸取上述标准储备液50 μL，用甲醇定容至10 mL，配成质量浓度为5.0 mg/L的混合标准储备液，于4 ℃下保存。

1.2.3 混合标准中间液分别准确吸取上述混合标准储备液100 μL，用甲醇定容至10 mL，配成质量浓度为50.0 μg/L的混合标准中间液，于4 ℃下保存。

1.2.4 内标工作液用甲醇分别将BPA-D16和BPS-13C12配成质量浓度为100 μg/L的同位素内标工作液，于4 ℃下保存。

1.2.5 基质混合标准工作液分别准确吸取50.0 μg/L的混合标准中间液0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1.0 mL，100 μg/L的内标工作液0.4 mL，用空白基质配成质量浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L的标准工作溶液，其中BPA-D16和BPS-13C12内标溶液的质量浓度为40.0 μg/L，现配现用。

1.3 样品前处理

1.3.1 提 取准确称取5 g(精确至0.01 g)经粉碎过筛后的样品，分别加入400 μL 100 μg/L的内标工作液BPA-D16和BPS-13C12，加入1 g氯化钠和适量硅藻土混匀后，装入34 mL不锈钢样品萃取池中，以乙腈-乙酸-水(89∶1∶10，体积比)为溶剂进行萃取。ASE条件：萃取温度为80 ℃，萃取压力为10.3 MPa，加热时间为5 min,静态萃取时间为6 min，冲洗体积为80%，氮气吹扫90 s，静态循环2次。收集全部萃取液于鸡心瓶中，于40 ℃下减压旋转蒸发至近干，用甲醇-水(1∶1，体积比)洗涤残渣，转移至带刻度的试管中，以甲醇-水(1∶1)定容至25 mL，待净化。

1.3.2 净 化取5 mL上述待净化样液，加入300 mg乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、300 mg C18、750 mg 无水MgSO4、600 mg胺丙基键合硅胶(-NH2),涡旋1 min，振荡5 min，于4 000 r/min离心5 min，取上清液1 mL氮吹至近干，用初始流动相复溶并定容至1 mL，过0.22 μm有机相滤膜，待上机分析。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters公司)；流动相：A为5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)，B为甲醇(含0.1%甲酸)。梯度洗脱条件：0～5 min，40% B；5～8 min，40%～60% B；8～10 min，60%～80% B；10～13 min，80% B；13～16 min，80%～40% B。进样体积：10 μL；流速：0.25 mL/min。

1.4.2 质谱条件离子源：电喷雾电离源(ESI)，正模式(ESI+)和负模式(ESI-)同时扫描;电喷雾电压：5 500 V(ESI+)和-4 500 V(ESI-)，雾化气压力(GS1)：50.0 kPa；气帘气压力(CUR)：25.0 kPa；辅助气压力(GS2)：50.0 kPa;离子源温度(TEM)：600 ℃；碰撞气电压(CAD)：Medium；扫描时间：50 ms；多反应监测(MRM)模式。11种双酚类化合物的质谱参数见表1。

表1 11种双酚类化合物及2种同位素内标的质谱参数Table 1 MS parameters for 11 BPs and 2 isotopic internal standards

(续表1)

CompoundCAS No.ESI modeIon pairsDP(V)CE(eV)BADGE-H2O-HCl227947-06-0Positive412.2>227.1*,412.2>135.063,5523,47BFDGE2095-03-6Positive330.2>163.2*,330.2>133.250,5618,23BFDGE-2H2O72408-26-9Positive366.3>181.2*,366.3>107.038,5320,46BPS80-09-1Positive251.1>157.2*,251.1>93.180,8023,34BPS-13C12-Positive263.1>163.2*,263.1>99.272,7224,37BPA80-05-7Negative227.1>212.1*,227.1>132.9-70,-70-25,-32BPA-D1696210-87-6Negative241.3>223.3*,241.3>142.3-85,-85-33,-28BPF620-92-8Negative199.0>93.1*,199.0>105.0-77,-77-29,-29

*quantitative ions；DP:declustering potential;CE:collision energy

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 ASE条件的选择萃取溶剂和萃取温度是ASE技术的关键，因此本实验主要对这两个条件进行优化。考虑到双酚类化合物的结构中均含2个及2个以上的苯环，易溶于乙腈，且乙腈中加酸有利于提高双酚类化合物的提取率[4]，因此考察了乙腈、乙腈-甲酸(99∶1)、乙腈-乙酸(99∶1)、乙腈-乙酸(95∶5)、乙腈-乙酸-水(89∶1∶10)5种萃取溶剂的提取效率(见图1)。结果表明，乙腈-甲酸(99∶1)、乙腈-乙酸(99∶1)、乙腈-乙酸(95∶5)、乙腈-乙酸-水(89∶1∶10)的萃取效率均优于乙腈，当增加乙酸比例时，BADGE、BPF的萃取效率明显降低。其中乙腈-乙酸-水(89∶1∶10)的萃取效率最高，可能是由于加适量水能够增强乙腈渗透到基质中的能力，从而提高目标物的提取率。因此，实验选择乙腈-乙酸-水(89∶1∶10)为最佳萃取溶剂。

图1 5种萃取溶剂对空白加标样品中双酚类化合物提取效率的影响Fig.1 Effect of 5 extraction solvents on the extraction efficiencies of bisphenols spiked in blank sample

考察了不同萃取温度(60、80、90、100 ℃)下的提取效率。结果显示，当温度从60 ℃升至80 ℃时，目标化合物的提取效率随之提高，这是因为温度的增加降低了萃取溶剂的粘度，提高了溶剂对基质的浸润能力。但当温度增至90 ℃时，所有化合物的提取效率开始降低，当温度增至100 ℃时，所有化合物的提取效率明显降低。因此，本实验选取80 ℃作为萃取温度。进一步实验发现，循环萃取2次和3次的结果无显著差异，考虑到萃取时间，选择循环2次。综上，本实验的最佳萃取条件如“1.3.1”所示。

2.1.2 净化填料的优化QuEChERS法的净化填料种类很多，其中乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)主要用于吸附糖类和有机酸等弱酸性成分，C18主要去除蛋白质和脂类成分，胺丙基键合硅胶(-NH2)能有效净化色素。由于药食同源性食品基质的提取液中可能含有色素、糖类、蛋白质和脂类等杂质，因此分别考察了上述 3种净化填料单独使用以及组合使用的净化效果。结果表明，3种净化填料组合使用的净化效果明显优于单一使用。此外，本实验选用300 mg C18、300 mg PSA和600 mg-NH2组合的净化方式，以增强净化能力，减小基质干扰和离子抑制作用，提高方法的准确度。

2.2 色谱-质谱条件的优化

2.2.1 色谱条件的优化比较了ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)和Thermo Aquasil C18(4.6 mm×100 mm,3.0 μm)2种色谱柱对11种双酚类化合物的分离效果。结果表明，在本实验条件下，T3柱对11种双酚类化合物的峰形和响应值优于C18柱，这是因为T3柱的内径和填料粒径均较小，能够达到良好的分离度。因此本实验选择T3柱进行分析。

由于双酚类化合物易溶于乙腈和甲醇，实验比较了乙腈-水和甲醇-水作为流动相的分离效果。结果表明，以乙腈-水为流动相时目标物的分离效果不佳，且响应值较低；以甲醇-水作为流动相时，11种目标物均能很好分离，目标峰响应值明显增大，且峰形均较好。此外，在流动相中加入0.1%甲酸有助于待测物母离子峰的形成，可提高待测物的离子化效应和灵敏度；在含0.1%甲酸的水相中加入5 mmol/L乙酸铵有助于消除钠盐的干扰，改善峰形拖尾。文献报道，梯度压缩效应可得到更窄的色谱峰，同时有利于提高方法的灵敏度[28]。故本研究采用甲醇(含0.1%甲酸)-5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)作为流动相，梯度洗脱的方式进行液相色谱分离。

2.2.2 质谱条件的优化取50.0 μg/L双酚类化合物标准溶液，分别在ESI+和ESI-模式下进行电离监测，结果表明，BPA、BPF在ESI-模式下的响应更好，其余9种双酚类化合物在ESI+模式下有更好的响应。负模式下BPA和BPF在一级全扫描质谱图中得到[M-H]-，正模式下其余9种双酚类化合物在一级全扫描质谱图中得到[M+NH4]+。通过Q3扫描确定子离子对，再优化各化合物的碰撞能量(CE)、去簇电压(DP)等参数。11种双酚类化合物的质谱参数见表1，正、负模式同时扫描的多反应监测色谱图见图2。

2.3 基质效应评价

按照本方法对空白样品进行提取净化，得到空白基质样液，向其中添加双酚类化合物标准溶液，配成质量浓度为0.5～50.0 μg/L的基质匹配标准溶液，同时配制相同质量浓度范围的溶剂标准溶液，进样分析，按照下式计算ME:ME=B/A×100%。其中，A和B分别为溶剂标准溶液和基质匹配标准溶液中双酚类化合物的峰面积。当ME大于100%时，表明存在离子化增强效应；当ME小于100%时，表明存在离子化抑制效应。

结果表明，ME为33.6%～126%，说明样品中存在一定的基质效应，可能是由于化合物竞争离子化所致。因此本实验采用基质匹配标准曲线的方法以减小基质效应的影响，同时采用同位素内标法以更加准确地定量。

2.4 方法学验证

2.4.1 线性关系、检出限与定量下限用空白基质样液配制系列标准工作溶液和内标溶液，以化合物的质量浓度为横坐标(X，μg/L)，峰面积为纵坐标(Y)进行线性拟合。结果表明，11种双酚类化合物在0.5～50.0 μg/L范围内具有良好线性，相关系数(r2)均不小于0.996 0；分别以3倍信噪比(S/N>3)和10倍信噪比(S/N>10)计算得到检出限(LOD)为0.1～0.5 μg/kg，定量下限(LOQ)为0.3～1.5 μg/kg(见表2)。

表2 11种双酚类化合物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限(LOD)及定量下限(LOQ)Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficients(r2),LODs and LOQs of 11 BPs

*IS:internal standard

2.4.2 回收率与相对标准偏差分别对葛根、山银花和沙棘3种空白样品进行2.0、10.0、25.0 μg/kg 3水平的加标回收实验，每个水平测定6次，按照本方法进行测定，通过内标法计算加标回收率及相对标准偏差(RSD)，结果见表3。由表3可知，11种双酚类化合物的平均回收率为72.4%～108%，RSD为1.7%～15%。

表3 11种双酚类化合物的回收率及相对标准偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of 11 BPs(n=6)

图3 葛根样品检出BFDGE的MRM色谱图Fig.3 MRM chromatogram of BFDGE in Pueraria lobata

2.5 实际样品测定

采用建立的方法对30批次的山银花、葛根和沙棘进行11种双酚类化合物的测定，其中1批次的葛根样品检出BFDGE，含量为0.5 μg/kg(见图3)，其余双酚类化合物均未检出。虽然目前我国未将食品及食品模拟物中BFDGE列入限量要求,但欧盟在EC/1895/2005号指令中明确禁止BFDGE在食品接触材料中使用，因此该产品存在一定的安全风险。

3 结 论

本文建立了一种基于ASE结合QuEChERS的前处理技术，采用超高效液相色谱-串联质谱同时测定药食同源性食品中11种双酚类化合物的检测方法。与传统方法相比，该方法自动化程度高、操作简单、检测时间短、灵敏度高、回收率较好，满足相关法规要求，可用于药食同源性食品中双酚类化合物的快速定性和定量分析。