艾灸神阙穴对溃疡性结肠炎小鼠血清促炎性因子及肠黏膜紧密连接蛋白的影响∗

穆韵浓 赵百孝 任俊逸 王宝泉 孔佑甲 安 雨 刘雅洁 张心悦 姚 琴 和 蕊

（北京中医药大学，北京 100029）

溃疡性结肠炎（UC）是一种发生于大肠黏膜及黏膜下层的非特异性炎症性肠病[1]，主要临床表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便、发热、贫血等[2]。其病因尚未明确，可能与感染、过敏、免疫系统紊乱、精神焦虑及抑郁等因素有关。研究表明，肠上皮屏障功能障碍是UC主要的致病因素，紧密连接结构是肠上皮屏障最重要的组成部分，能防止肠腔内致病性抗原，如细菌、病毒、内毒素等物质进入黏膜固有层和血液循环[3]。Occludin、ZO-1是肠上皮屏障中两个重要的紧密连接蛋白，具有调节细胞间物质流动、维持上皮细胞极性、阻止毒性大分子和微生物通过等功能，在维护肠道屏障功能中发挥关键作用[4-5]，同时影响炎性因子的表达，进而调节机体炎性反应。本研究采用艾灸神阙穴法干预3.5%葡聚糖硫酸钠造模的UC小鼠，观察其对UC小鼠肠上皮Occludin、紧密连接蛋白1（ZO-1）的蛋白表达和促炎性因子白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响，进而探讨艾灸神阙穴治疗UC的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

32只健康雄性ICR小鼠，体质量20～23 g，购自维通利华（北京）生物技术有限公司，许可证号：SYXK（京）2016-0038。常规饲养于北京中医药大学SPF级动物房，12 h光照/黑夜循环，温度20～24℃，湿度50%～60%，自由饮食饮水饲养。小鼠购进后先适应性喂养1周。

1.2 药物与试剂

特制细艾条（河南南阳汉医艾绒有限公司，规格0.5 cm×20 cm）；DSS（美国MP Biomedicals公司，批号Q1723）；美沙拉嗪缓释颗粒剂（上海爱的发制药有限公司，国药准字H20143164）；便隐血试剂（珠海贝索生物技术有限公司，规格200测试/盒）；小鼠白细胞介素6酶联免疫试剂盒（Mouse IL-6 ELISA Kit RGB&CHN Lot：20200109.60023M）；小鼠肿瘤坏死因子α酶联免疫试剂盒（Mouse TNF-α ELISA Kit RGB&CHN Lot：20200109.60080M）；Anti-ZO1 tight junction蛋白抗体（abcam公司，ab216880）；Anti-Occludin抗体[EPR8208]（bcam公司，ab167161）。

1.3 实验仪器

Fresco低温冷冻离心机（Thermo）；Multi Skan3酶标仪（Thermo）；小鼠固定器（上海华岩仪器设备有限公司，规格 150 mm×65 mm×50 mm）；Thermo Multiskan MK3（产地：芬兰）；Mini P-4电泳槽（Cavoy）；湿转电泳槽（Cavoy）；电泳仪（Bio-Rad）；半干槽（Bio-Rad）；水平脱色摇床（其林贝尔）；酸度计pH211（Hanna）；电动组织匀浆器（Fluka）；石蜡切片机（LEICA，RM 2235）；石蜡包埋机（LEICA，EG 1160）；光学显微镜（OLYMPUS，50X）。

1.4 分组及造模

适应性饲养1周后，随机选取8只小鼠作为空白对照组，其余24只均通过自由饮用3.5%DDS溶液8 d进行造模，造模成功后，再将24只模型小鼠随机分为模型组、阳性药物组和艾灸组，每组8只。

1.5 干预方法

造模完成后次日开始分组干预，持续8 d。空白对照组和模型组：将小鼠放入固定器，固定头、尾、四肢部位，每次20 min，每日1次。阳性药物组：按0.4 g/kg体质量灌胃美沙拉嗪溶液，每日1次。艾灸组：将小鼠放入固定器固定，固定头、尾、四肢部位，将固定器架起，固定器底部设有椭圆形孔，可暴露小鼠腹部神阙穴，点燃艾条并放置在小鼠神阙穴位置下方，进行艾灸。在艾灸过程中，不断调整艾条高度，使艾灸的温度基本保持恒定。艾灸干预每次20 min，每日1次，共8 d。

1.6 疾病活动指数（DAI）评估

造模第1天起记录小鼠的体质量变化、排便情况、便隐血情况，并作为评价指标。各指标评分方式如下。1）体质量下降率：无下降0分；下降1%～5%记1分；下降5%～10%记2分；下降10%～15%记3分；下降率大于15%记4分。2）便质情况：正常记0分，稀软便记2分；水样便记4分；3）便潜血情况：阴性记0分；阳性记2分；肉眼血便记4分。DAI评分为3项评分的平均值。DAI=（体量下降评分+大便形状评分+大便隐血情况评分）/3。

1.7 标本采集与检测

末次干预后，禁食不禁水12 h，测量体质量后，用3.5%水合氯醛0.1 mL/10 g腹腔注射麻醉，摘眼球取血后迅速脱椎处死，并剖开腹部，分离结肠，自耻骨联合处至盲肠取下整段结肠，沿肠系膜纵行剖开，予生理盐水和PBS缓冲液中轻柔漂洗后肉眼观察结肠大体形态，自下而上将截取结肠分成两部分，一部分固定于4%多聚甲醛固定液中，用于形态学观察；剩余部分置于液氮1 h后转移至-80℃冰箱保存备用。血样静置1 h后离心，取上清液用于ELISA检测。

1.7.1 结肠组织病理学观察 结肠组织切片采用HE染色后，于光学显微镜下观察病理学变化。

1.7.2 Western blotting法检测各组小鼠结肠组织Occludin、ZO-1蛋白的相对表达水平 用眼科剪剪碎组织块，称重研磨后以质量∶裂解液体积=1∶9的比例加入裂解液，匀浆，离心后取上清，进行细胞蛋白抽离，采用BCA法进行蛋白定量。根据目的蛋白的分子量，配制12%～15%分离胶，5%浓缩胶浓度进行SDSPAGE电泳分离，电泳至溴酚蓝到凝胶底部停止分离，于300 mA恒流和0.45 μm孔径NC膜条件下进行湿法转膜2 h，封闭于5%脱脂奶粉-TBST中60 min，用5%脱脂奶粉-TBST稀释稀释一抗，室温孵育10 min，放4℃过夜，第2天拿出在室温下孵育30 min，进行洗膜5次，每次3 min。加入稀释浓度1∶5 000的二抗室温轻摇40 min，洗膜。加ECL后反应3～5 min，曝光，显影定影。采用凝胶图像处理系统分析目标带的相对表达量。

1.7.3 ELISA法检测IL-6和TNF-α 取小鼠清晰非溶血的血清样品100 μL，采用ELISA法测定TNF-α和IL-6含量。

1.8 统计学处理

应用SPSS20.0统计软件。数据以（）表示。符合正态分布且方差齐则采用单因素方差分析进行数据比较，多组间两两比较采用LSD-t检验，如若不符合正态分布或方差齐性检验，则采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠的一般情况

空白对照组小鼠体质量随饲养时间增长，反应灵敏，眼神灵活，大便呈正常性状，毛发亮泽。模型组小鼠在造模过程中出现腹泻、便血、肛门周围有血及污秽附着、饮食较差、体质量减轻、毛发凌乱无光泽、精神呆滞等情况。各组开始不同干预后，艾灸组小鼠体质量与阳性药物组小鼠相比增长较慢，随着治疗次数的增加，小鼠便血情况逐渐减弱甚至消失，精神状态逐渐恢复，尤其艾灸组小鼠大便形状恢复正常速度较快，艾灸第2～3天大部分小鼠已经由稀便转至正常。

2.2 各组小鼠DAI评分比较

与空白对照组比较，模型小鼠第2天即出现便潜血阳性，第3～4天即出现肉眼可见血便、稀便，同时体质量明显下降，食量减少，活动度低，毛色变差；随着饮用DSS溶液时间的延长，各现象逐渐加重。在第8天对各组实行不同干预后，艾灸组与阳性药物组的体质量下降程度、大便性状和便血现象均得到改善。与空白组相比，模型组的DAI评分[（1.27±0.51）分]显著增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与阳性药物组[（1.34±0.49）分]相比，艾灸组DAI评分[（2.38±0.57）分]减少，差异无统计学意义（P＞0.05）。可见艾灸组可以降低UC小鼠的DAI评分。

2.3 各组小鼠结肠组织形态比较

见图1。镜下观察发现，空白组结肠黏膜上皮完整，上皮细胞连接紧密，结肠肠腺排列规整，无明显炎性细胞浸润，未见明显病变表现。模型组可见黏膜层缺损，上皮细胞连接松散，杯状细胞减少，隐窝破坏，可见大量中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润。艾灸组、阳性药物组小鼠结肠组织病理形态改善明显，黏膜缺损情况较模型组均得到明显修复，结肠黏膜上皮较完整，细胞连接较紧密，极少隐窝破坏，基本无明显炎性细胞浸润，杯状细胞分泌增多。

图1 各组小鼠结肠组织形态病理学观察（HE染色，400倍）

2.4 各组小鼠结肠组织Occludin、ZO-1蛋白的相对表达水平比较

见图2，表1。与空白对照组相比，模型组Occludin和ZO-1蛋白表达量明显降低（P＜0.01）。与模型组相比，艾灸组Occludin和ZO-1蛋白表达量明显提升（P＜0.01），与阳性药物组趋势一致，提示艾灸组可提高UC小鼠肠上皮紧密连接蛋白含量，对肠上皮屏障恢复具有正向影响。

图2 各组小鼠肠上皮ZO-1、Occludin蛋白的表达

表1 各组小鼠肠上皮ZO-1、Occludin蛋白相对表达量比较（±s）

表1 各组小鼠肠上皮ZO-1、Occludin蛋白相对表达量比较（±s）

与模型组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01。下同

组别空白对照组模型组艾灸组阳性药物组n 6 6 6 6 ZO-1 9.48±2.64**2.82±1.51 6.77±1.82**7.08±1.88**Occludin 8.29±1.61**2.55±0.79 7.59±1.56**6.83±1.24**

2.5 各组小鼠血清IL-6和TNF-α含量比较

见表2。小鼠血清中IL-6和TNF-α水平均呈空白对照组<艾灸组<阳性药物组<模型组的趋势。与空白对照组相比，模型组IL-6和TNF-α水平明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，艾灸组及阳性药物组IL-6和TNF-α水平明显降低（P＜0.05）；艾灸组和阳性药物组相比无明显差异（P＞0.05）。

表2 各组小鼠血清中IL-6、TNF-α含量比较（ng/L，±s）

表2 各组小鼠血清中IL-6、TNF-α含量比较（ng/L，±s）

组别空白对照组模型组艾灸组阳性药物组n6 6 6 6 IL-6 24.33±3.75*47.53±10.25 26.02±4.90*32.43±3.70*TNF-α 40.12±6.19*74.93±16.28 42.07±8.02*53.13±6.02*

3 讨论

UC属于炎性肠病的一种，在临床上属于难治疾病，近年来我国UC患者逐渐增多[6]，其发病机制与特异性病因尚不明确，可能与环境和人体免疫机制异常等诸多因素有关[7]。越来越多的文献证实了UC的发生、恢复与肠黏膜屏障存在密切关系，所以促进肠上皮屏障恢复、维持肠黏膜系统稳态，是治疗UC的重要环节[8]。现阶段临床治疗UC主要以柳氮磺胺吡啶水杨酸制剂和皮质类固醇类药物为主，但效果并不十分理想且容易对机体正常免疫机制等产生影响。所以，寻找一种安全、绿色的疗法是当前治疗UC的需求。

艾灸具有“温通经脉，行气活血，调整脏腑阴阳平衡”的作用。艾灸法操作简便易学、绿色安全、经济易普及，无论是日常保健还是临床应用都十分广泛。艾灸通过刺激穴位，激发经络，调节阴阳，从而治疗疾病。现代医学研究表明，脐作为胚胎发育过程中的重要部分，通过丰富的血管、神经和淋巴管等传输营养，出生以后闭合，且皮下无脂肪组织，紧邻各种腹腔内组织器官，所以可通过脐局部干预获取临床效果[9]，选取位于此处的神阙穴，可培补元气、理顺肠胃。神阙又属下焦之枢纽，邻近胃与大小肠，有健脾养胃、理肠止泻之功效。UC可能与湿热凝滞、邪毒伏内、脾肾阳虚、隐血亏虚等有关，针对于此，我们以固护脾肾、行气活血、祛湿通滞为则，采用艾灸神阙穴法，调整胃肠气机，通行全身气血，激发肾间动气和脾胃之气，从而恢复肠黏膜组织屏障稳态，促进UC患者康复。

肠黏膜是肠屏障的重要组成部分[10]。肠黏膜屏障分为上皮、生物、免疫、化学四部屏障，其中上皮（机械）屏障是肠黏膜屏障的首道重要防线[11-12]，肠机械屏障主要指的是肠上皮细胞以及细胞间的连接。紧密连接蛋白主要起着调节细胞的通透性，在细胞内外环境进行信号传递，调节细胞生长、表型、极性等作用。在肠道生理中，ZOs作为免疫组织化学检查时的标志性蛋白，对于细胞间紧密连接的形成和屏障功能的维持具有重要作用。紧密连接结构一旦受损，肠黏膜通透性就会增加，从而引发生炎性反应。ZO-1对协调紧密连接复合物有着重要的作用，同时还调控着细胞旁路屏障功能和肠上皮细胞通透性[13]。它的表达分布密切影响着紧密连接的功能及结构。Occludin蛋白作为跨膜蛋白，是紧密连接中最重要的结构蛋白，不仅能通过外环以拉链式结合进而产生严密的细胞旁封闭，还能与不同的分子结合，参与紧密连接形成的信号调节[14]。本研究结果显示，经过DSS造模后的小鼠肠上皮屏障与空白对照组相比严重受损，出现明显黏膜层缺损，上皮细胞连接松散等现象，ZO-1和Occludin的蛋白表达也与空白组有明显差异。经干预后，艾灸组的ZO-1和Occludin蛋白表达明显增强，病理切片观察也有明显改善，与阳性药物组趋势一致，提示艾灸治疗UC的起效机制可能与肠上皮屏障中紧密连接蛋白的表达有关。

在免疫屏障中，与UC关系密切的促炎因子主要有IL-1、IL-6、TNF-α等，这些炎性因子的表达与UC发病过程中病理组织行程及炎性反应有很大关系[15]。文献表明，TNF-α是UC发病机制中的启动因子之一，在巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的细胞质中表达，通过诱导中性粒细胞的聚集，对淋巴细胞产生刺激进而发生炎症反应[16]。在正常情况下，TNF-α可抗感染、抗肿瘤，若释放时间过长或释放量过多则可产生疾病反应。IL-6是一种作用广泛的促炎性因子，可促进T细胞、B细胞的活化、增生及毒性反应[17]。TNF-α可诱导IL-6生产，而过高的IL-6表达可刺激淋巴B细胞合成自身抗体，增强TNF-α的表达，从而加重炎性反应。实验结果表明，模型组小鼠血清中的TNF-α和IL-6明显增加，高于空白组，证明模型组小鼠炎性反应较大，而经过艾灸神阙穴处理后，两种炎性因子的表达均下降，差异具有统计学意义，趋势与阳性药物组一致，提示艾灸对UC的治疗也在免疫机制中有效。

一系列研究发现UC患者血清中IL-6和TNF-α浓度明显升高，且与病变范围和病变严重程度成正相关。如果肠上皮屏障系统受到损害或构成紧密连接的蛋白表达异常，则会导致ZO-1和Occludin表达量下降，肠上皮细胞通透性增加，内毒素、细菌及大分子物质会通过肠上皮进入血液循环，进而诱导免疫反应，引起并加重UC[14]。因此，肠黏膜各屏障协同作用，共同保护肠黏膜，本文从免疫屏障和上皮屏障共同论述，观察IL-6和TNF-α、紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达情况，作为治疗的切入点和靶点，对UC治疗是十分重要的。

越来越多的临床和实验研究表明，艾灸在UC的治疗和康复上有明显疗效，在调节机体免疫平衡、改善肠道黏膜病变、控制肠道炎症中起重要作用[18]。艾灸能下调肠黏膜炎性因子IL-6/TNF-α的表达和升高上皮屏障ZO-1和Occludin的蛋白表达，从而减轻炎症反应，恢复肠道屏障，本研究结果可为UC的防治提供一定的研究依据。