平喘颗粒对哮喘大鼠肺组织树突细胞CD80、CD86、MHCⅡ表达的影响∗

李竹英 高风丽 李寒梅

（黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040）

哮喘是一种发病原因和机制比较复杂的异质性疾病，其发生发展与机体免疫失衡密切相关[1]。抗原递呈细胞（APC）是启动哮喘气道免疫反应的关键，而树突细胞是目前已知功能最强的专职性APC，最大特点是能够显著刺激辅助性T细胞增殖和分化。辅助性T细胞的分化方向决定着哮喘特征性的病理生理过程[2-3]。平喘颗粒是黑龙江中医药大学自制的中药制剂，前期临床研究显示平喘颗粒对改善哮喘患者的临床症状，提高患者的FEV1、PEF水平具有较好疗效，但其具体机制尚不清楚[4-5]。本研究通过观察平喘颗粒对哮喘大鼠肺组织树突细胞表面因子的影响，探讨其作用机制，为临床研究提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠，40只雌雄各半，由延边大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（吉）-2011-0007，体质量（200±20）g，室温17～25 ℃，相对湿度45%～65%。

1.2 试药与仪器 平喘颗粒，组成：淫羊藿200 g，太子参 150 g，黄芪 150 g，五味子150 g，知母100 g，炙麻黄100 g，款冬花（炙）150 g，地龙100 g，罂粟壳40 g。上药加水煎煮2次，每2小时过滤1次，通过醇沉方式[6]浓缩成稠膏，相对密度为1.20～1.25（60 ℃），由黑龙江中医药大学附属第一医院将其制备成1 000 g干燥颗粒，灌胃前用温水稀释成1.08 g/mL含药溶液。卵蛋白（OVA），美国 Sigma公司；氯喹，美国 Sigma-Al⁃drich；Anti-CD86抗体[EP1158Y]，英国abcam；Anti-CD80 antibody（PE），英国abcam；PE－Cy5－MHCⅡ抗体，英国abcam。Lx81研究级倒置荧光显微镜，日本Olymps公司；SW-CJ-2FD/标准配置超净工作台，上海博迅；Facscaliber流式细胞仪，美国BD公司；超薄切片机，上海五相仪器仪表厂。

1.3 分组与造模 40只Wistar大鼠随机分为4组，每组10只，分别是空白组、哮喘组、自噬抑制剂组、平喘颗粒组。空白组以生理盐水代替OVA激发，其他组应用OVA致敏液[10 mg OVA+100 mg Al（OH）3凝胶的无菌抗原液]激发，制备慢性哮喘大鼠模型。于实验第0、12日给予大鼠腹腔注射10%OVA致敏液1 mL致敏，之后将致敏液浓度改为5%，每天激发30 min，激发5 d后改为隔1 d激发1次，连续激发6周。

1.4 给药方法 空白组、哮喘组给予生理盐水灌胃（5 mL/kg），自噬抑制剂组在第2次致敏后第4天开始给予60 μg/g氯喹腹腔注射，激发阶段则每次激发前1 h给予氯喹腹腔注射；平喘颗粒组给予中药药液5 mL/kg灌胃，时间同自噬抑制剂组。

1.5 标本采集与检测 各组大鼠末次激发24 h后处死，开胸取固定的肺组织行石蜡包埋、切片，将病理切片行HE染色，光镜下观察肺组织炎性浸润情况。采用免疫组化（OX-62标记）检测肺组织DCs浸润情况。同时取大鼠右肺的前叶及中叶部分，经PBS过滤、漂洗后，加入分选磁柱中，通过PBE冲洗收集DCs。将各组获取的DCs重悬于300 μL预冷的PBS中，以备流式细胞仪检测。

1.6 统计学处理 应用SPSS20.0软件进行数据分析，计量数据以（±s）表示，两两比较用独立样本t检验，组间比较用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织光镜下结果 空白组大鼠肺组织及支气管结构基本上处于正常状态，肺泡轮廓清晰。哮喘组大鼠肺组织及支气管外周可见大量的炎性细胞浸润，肺泡结构异常。自噬抑制剂组大鼠肺组织结构正常，肺泡腔大小均一，组织中及支气管外周可见炎性细胞浸润灶。平喘颗粒组大鼠肺组织结构正常，肺泡轮廓清晰，组织中及支气管外周可见多个中等大小的炎性细胞浸润灶。见图1。

图1 各组大鼠肺组织病理观察（HE染色，200倍）

2.2 各组大鼠肺组织DCs浸润情况比较 见表1，图2。大鼠哮喘模型造模成功后，肺组织DCs浸润数量增多，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。给予自噬抑制剂和平喘颗粒治疗后，肺组织DCs浸润数量减少，与哮喘组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但自噬抑制剂组与平喘颗粒组之间无显著差异（P＞0.05）。

表1 各组大鼠肺组织DCs浸润情况比较（±s）

表1 各组大鼠肺组织DCs浸润情况比较（±s）

与空白组比较，∗P＜0.05；与哮喘组比较，△P＜0.05。下同

组别空白组哮喘组自噬抑制剂组平喘颗粒组n 10 10 10 10 DCs浸润数量（个）14.26±1.43 53.63±3.76*34.40±1.00*△34.62±2.93*△

图2 各组肺组织DCs浸润光镜下观察（OX-62蛋白免疫组化，200倍）

2.3 各组大鼠DCs CD80、CD86及MHCⅡ表达比较见表2。造成大鼠哮喘模型后，DCs表面各因子表达增高，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。给予自噬抑制剂和平喘颗粒治疗后，DCs表面各因子表达下降，与哮喘组比较差异有统计学意义（P＜0.05），但自噬抑制剂组与平喘颗粒组之间无显著差异（P＞0.05）。

表2 各组大鼠CD80、CD86及MHCⅡ表达比较（%，±s）

表2 各组大鼠CD80、CD86及MHCⅡ表达比较（%，±s）

组别空白组哮喘组自噬抑制剂组平喘颗粒组n 10 10 10 10 CD80 31.98±1.84 81.86±4.11*61.10±2.07*△61.56±2.62*△CD86 38.18±1.26 72.67±2.63*53.06±2.99*△55.17±2.47*△MHCⅡ34.54±1.20 75.08±2.14*59.59±2.40*△57.62±2.63*△

3 讨论

DCs是哮喘发生和发展中的一种关键免疫细胞，一方面在机体受到外界细菌、病毒和变应原刺激时，可在肺组织和刺激部位呈现聚集状态，将抗原传递给局部淋巴结的T细胞区；另一方面，DCs可促进T细胞向Th2极化，引起Th1/Th2平衡失调，进而导致哮喘的发生[7-9]。研究发现通过抑制树突细胞TIM4水平，抑制Th2细胞的表达，调控Th1/Th2向Th1极化，可以减轻哮喘小鼠的气道炎症反应[10]。可见，DCs可通过参与哮喘的炎性反应过程和诱导免疫耐受两方面，成为治疗哮喘的潜在靶点。不同成熟阶段的DCs抗原递呈能力有所差异，未成熟的DCs（iDCs）通常不激活T细胞，当机体受到抗原刺激时，DCs被活化成熟，迁移到淋巴结的T细胞区发挥抗原递呈作用，此时DCs表面的共刺激分子CD80、CD86和MCHⅡ分子呈高表达状态[11-12]。DCs在成熟过程中细胞表面表达的共刺激分子CD80和CD86与T细胞表面表达的CD28分子相互作用，共同促进T细胞向Th2分化，诱导哮喘发作[13-14]。MHCⅡ作为DCs表面的抗原提呈分子，与外源性抗原结合成复合物形式提呈给CD4+T细胞，从而成为T细胞活化的第一启动信号[15-16]。平喘颗粒由淫羊藿、太子参、黄芪、五味子、知母、炙麻黄、款冬花、罂粟壳、地龙组成。方中淫羊藿、炙麻黄共为君药，具有温补肾阳，宣肺平喘之功；黄芪、太子参、五味子、款冬花、地龙共为臣药，具有益气助阳，润肺生津，止咳平喘之功；罂粟壳敛肺止咳，为方中之佐药；知母润肺止咳，引方中诸药归经，为方中之使药。诸药合用使肾阳得补，脾气得健，肺气得以宣畅，共奏温阳益气，化痰平喘之效。流式结果显示，经OVA激发后，与空白组相比，其余各组大鼠肺组织DCs表面CD80、CD86、MHCⅡ的表达均升高。其中在平喘颗粒组和自噬抑制剂组中，上述因子的表达均较哮喘组降低，而两组之间比较差异无统计学意义。综上所述，平喘颗粒可以改善哮喘大鼠肺组织中的炎症反应及DCs浸润情况，从而抑制哮喘的发生，其机制可能与本方降低DCs表面CD80、CD86、MHCⅡ的表达有关。本研究对平喘颗粒治疗哮喘的作用机制做了进一步的探讨，但中药治疗疾病的机制往往是多元化的，未来我们仍需要大量的研究去阐释更深、更广的作用机制。