芍药甘草汤对呼吸道合胞病毒诱发哮喘急性加重小鼠相关炎症因子、Bcl-2和Bax表达及免疫功能的影响∗

何玉敏 王进燕 何冰杰 王 富 黎小妹 张吉发

（1.海南省琼海市人民医院，海南 琼海 571400；2.山东省青岛市即墨区中医医院，山东 青岛266200；3.海南省妇女儿童医学中心，海南 海口 571100；4.上海市第六人民医院南院，上海 201400）

哮喘是由多种细胞和细胞组分参与的一种气道慢性炎症性疾病，以可逆性气道受阻和气道高反应性为主要特点。中医学上，哮喘属于“哮证”的范畴，病位在肺，多以邪实为主，常因腑脏功能失调、情志郁怒、饮食不节、外邪侵体、气候改变等原因，导致肺失宣降、痰气互结、壅阻气道、通畅失利、肺气郁闭，发为哮喘[1-2]。目前，临床治疗哮喘以糖皮质激素联合β2受体激动剂为常用药物，β2受体激动剂直接扩张支气管，糖皮质激素则通过强大的抗炎作用抑制气道重塑，二者合用可发挥显著的平喘作用，但糖皮质激素长期或大量应用可引起多且严重的不良反应，甚至会诱发其他疾病，寻求中医药干预已成为临床治疗哮喘的重要方向。本研究观察芍药甘草汤对呼吸道合胞病毒（RSV）诱发哮喘急性加重模型小鼠细胞相关炎症因子、Bcl-2和Bax表达及免疫功能的影响，探讨芍药甘草汤对RSV诱发哮喘急性加重的治疗效果及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 50只健康Balb/c小鼠（雌雄不拘），5～6周龄，体质量（17±2）g，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，合格证号：110011191100312。室温饲养，自由饮水进食，符合《实验动物管理条例》要求。

1.2 药物与试剂 芍药甘草汤组成：芍药与甘草等量（1∶1），饮片均由琼海市人民医院中药房提供，药材加水煎煮2次，合并药液，生药含量1 g/mL。地塞米松片（广东华南药业集团有限公司，批号：20190316，规格：0.75 mg）；卵白蛋白（美国Sigma公司，批号：A6275）；氢氧化铝凝胶（上海凌峰化学试剂有限公司，批号：030M1549）；RSV病毒（武汉华东试验试剂公司）；水合氯醛（分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司）；苏木精-伊红染色液（武汉华美生物工程有限公司）；DAB显色剂（武汉博士德生物公司）；Bcl-2、Bax抗体购自美国 Santa Cruz公司；Envision试剂（HRP/Rabbit）即用型购自丹麦Dako公司；白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-13（IL-13）、白细胞介素-17（IL-17）试剂盒、免疫球蛋白E（IgE）试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司。

1.3 实验仪器 RM2235型病理切片机（德国Li-co公司）；BX60显微镜（日本Olympus Optical公司）；LDZ-2型低速离心机（北京京立离心机有限公司）；OLYM⁃PUSAU5400全自动生化分析仪（日本奥林巴斯有限公司）；402AI型超声雾化器（上海鱼跃医疗设备有限公司）；ELx800酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。

1.4 分组与造模 小鼠分为空白组10只、手术组40只，其中手术组又分模型组、西药组（地塞米松组）、中药组（芍药甘草汤组）、联合组（地塞米松+芍药甘草汤）。参照文献[3]，除空白组外，其余实验小鼠分别于第1日和第8日腹腔注射0.5 mL含100 μg卵白蛋白和1 mg氢氧化铝凝胶的无菌抗原液，使小鼠致敏。致敏后14 d内为激发阶段，用1%卵白蛋白生理盐水溶液5 mL雾化吸入激发，隔日1次，每次30 min，连续2周；如小鼠出现精神萎靡、饮食与活动减少、呼吸频率加快等情况，表示成功，停止激发。激发成功后，分别于第22、36、50日用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，以滴度为1.0×106pfu的RSV 5 μL滴鼻，使小鼠感染RSV诱发哮喘。RSV滴鼻后，如小鼠出现打喷嚏，鼻腔有少量卡他样无色透明分泌物、弓肩耸背、点头样呼吸、腹肌抽搐、甚至站立不稳等现象，即为哮喘急性发作，提示建模成功。空白组用等量生理盐水代替卵白蛋白进行腹腔注射和雾化吸入以及RSV滴鼻。

1.5 给药方法 建模成功后第2日进行干预。空白组和模型组给予生理盐水灌胃，剂量为10 mL/（kg·d）。西药组给予地塞米松灌胃，1 mg/（kg·d）。中药组给予芍药甘草汤灌胃，5 g/（kg·d）。联合组给予地塞米松和芍药甘草汤灌胃，剂量同上。各组每日灌胃1次，连续治疗10 d。

1.6 标本采集与检测 1）炎症因子测定。处死各组小鼠前，心脏取血，离心，取上层血清，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清IL-6、IL-13、IL-17水平，严格按说明书操作。2）Bcl-2及Bax蛋白表达检测。肺组织常规病理切片，选取组织标本蜡块进行Envision法免疫组化检测。石蜡切片常规脱蜡脱水，PBS漂洗3次，3 min/次；滴加 0.3%H2O2，室温静置 15～20 min，PBS漂洗3次；滴加20%正常山羊血清封闭液，室温孵育30 min；滴加一抗，Bcl-2和Bax按照一定浓度稀释，室温孵育10～15 min，4℃过夜，37℃复温30 min，PBS漂洗3次，5 min/次；滴加Envision试剂（HRP/R），37℃孵育30 min，PBS洗3次，5 min/次。DAB显色8～12 min；苏木素复染，热水蓝化；脱水，透明，树脂封片；烤片，拍照。Bcl-2和Bax蛋白染色呈棕黄色或黄色，在高倍镜下每张切片随机选取3个视野，计算支气管壁和肺组织Bcl-2和Bax阳性面积百分比，取平均值作为最终结果。3）免疫球蛋白IgE含量测定。处死各组小鼠前，心脏取血，离心，取上层血清，采用ELISA法测定各组小鼠血清IgE水平，严格按说明书操作。

1.7 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用t检验完成计量资料比较；采用χ2检验进行计数资料的比较，以n（%）表示计数资料。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠肺组织病理学比较 见图1。空白组支气管管腔光滑，上皮完整，气道黏膜无水肿，肺泡间隔正常，气道及肺泡偶见嗜酸性粒细胞浸润。模型组支气管管腔变形、狭窄，气道周围血管扩张充血，可见大量淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润，肺泡间隔增厚，气道平滑肌增生变厚。西药组支气管管腔正常，上皮基本完整，气道黏膜无明显水肿，肺泡间隔基本正常，气道壁无明显嗜酸性粒细胞浸润。中药组支气管管腔基本正常，气道黏膜轻度水肿，嗜酸性粒细胞浸润显著降低。联合组仅少量嗜酸性粒细胞浸润。

图1 各组小鼠肺组织病理学比较（HE染色，200倍）

2.2 各组小鼠炎症因子水平比较 见表1。与空白组相比，模型组IL-6、IL-13、IL-17水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组小鼠IL-6、IL-13、IL-17水平均显著降低（P＜0.05）；与西药组比较，中药组小鼠IL-6、IL-13、IL-17水平明显偏高（P＜0.05）；西药组与联合组小鼠IL-6、IL-13、IL-17水平无明显差异（P＞0.05）。

表1 各组小鼠炎症因子水平比较（ng/L，±s）

表1 各组小鼠炎症因子水平比较（ng/L，±s）

与对照组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与西药组比较，▲P＜0.05。下同

组别n IL-6IL-13IL-17空白组模型组西药组中药组联合组10 10 10 10 10 7.14±0.86 22.31±1.78*12.59±1.25*△17.14±1.66*△▲13.37±1.12*△10.78±1.64 30.47±6.28*16.83±5.96*21.12±8.05*△▲18.07±6.39*△18.40±1.91 43.52±5.48*20.36±4.35*△28.96±4.74*△▲22.27±3.56*△

2.3 各组小鼠Bcl-2、Bax蛋白表达比较 见表2，图2～图3。空白组小鼠肺组织及气道Bcl-2的阳性面积比率最低、Bax的阳性面积比率最高。与空白组比较，模型组小鼠肺组织及气道Bcl-2阳性面积明显增高、Bax阳性面积明显降低（P＜0.05）。与模型组相比，各治疗组小鼠的肺组织及气道Bcl-2阳性面积均显著降低、Bax阳性面积均显著升高（P＜0.05）；与西药组比较，中药组小鼠肺组织及气道Bcl-2阳性面积明显偏高、Bax阳性面积明显偏低（P＜0.05）；西药组与联合组小鼠肺组织及气道Bcl-2阳性面积、Bax阳性面积相比无显著差异（P＞0.05）。

表2 各组小鼠Bcl-2、Bax蛋白表达比较（%，±s）

表2 各组小鼠Bcl-2、Bax蛋白表达比较（%，±s）

组别空白组模型组西药组中药组联合组n 10 10 10 10 10 Bcl-2阳性面积百分比10.41±2.03 54.52±8.28*20.86±6.42*△34.18±7.35*△▲22.77±6.86*△Bax阳性面积百分比48.14±8.87 14.64±3.36*39.32±7.23*△29.29±6.45*△▲36.27±7.02*△

图2 各组小鼠肺组织Bcl-2蛋白表达（DAB染色，200倍）

图3 各组小鼠肺组织Bax蛋白表达（DAB染色，200倍）

2.4 各组小鼠IgE含量比较 见表3。与空白组相比，模型组IgE水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各治疗组小鼠IgE水平均显著降低（P＜0.05）；与西药组比较，中药组小鼠IgE水平明显偏高（P＜0.05）；西药组与联合组小鼠IgE水平无明显差异（P＞0.05）。

表3 各组小鼠IgE含量比较（U/mL，±s）

表3 各组小鼠IgE含量比较（U/mL，±s）

组别空白组模型组西药组中药组联合组n 10 10 10 10 10 IgE 14.82±1.31 92.73±5.46*22.32±2.38*△35.94±3.22*△▲24.94±2.22*△

3 讨 论

哮喘的发病机制目前尚不完全明确，气道炎症认为是重要的发病机制之一[4-5]。当敏感个体被过敏原刺激时会发生异常免疫应答，激活T淋巴细胞增殖分化为Th2细胞，而Th1/Th2失衡与Th17细胞大量增多是哮喘气道炎症的重要机制[6]。Th2、Th17细胞能产生多种炎症因子如 IL-4、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-α等。其中IL-6是Th17细胞增殖分化的关键因子[7]，IL-17具有强大的致炎作用；IL-13是Th2细胞分泌的多效能细胞因子，可不依赖于IL-4、IgE及嗜酸性粒细胞等传统途径而诱发哮喘[8]。在多种细胞因子的作用下，炎症细胞进一步激活，炎症因子分泌增加，同时可介导嗜酸粒细胞、中性粒细胞趋化，诱发哮喘急性加重[9]。Th2细胞释放炎症因子的同时使B细胞增殖加速，并诱导其产生的抗体类型转向IgE[10]。lgE可引起Ⅰ型超敏反应，水平升高会加重哮喘气道炎症反应，诱发多种炎症因子大量释放，使哮喘急性加重。因此，降低IL-6、IL-13、IL-17和IgE水平对减轻气道炎症，缓解哮喘急性发作有重要治疗意义。

嗜酸性粒细胞是哮喘发病的关键效应细胞之一，其炎性浸润与哮喘变应性炎症反应密切相关[11]。当RSV感染后，病变部位的嗜酸粒细胞数目明显增多，多种免疫细胞被激活并趋化，使哮喘急性加重，因此加快嗜酸性粒细胞凋亡，对消除气道炎症、缓解哮喘发作有重要意义[12]。细胞凋亡受多种基因调控，Bcl-2和Bax被认为是关键基因，其中Bcl-2为抑制凋亡基因，Bax是促凋亡基因。Bcl-2可通过抑制诱导因子被激活，抑制细胞凋亡[13]；Bax是 Bcl-2的拮抗蛋白，通过拮抗Bcl-2的功能促进细胞凋亡。当Bcl-2过高时，抑制生物体内细胞凋亡；反之，Bax升高促进细胞凋亡[14]。因此维持Bcl-2和Bax平衡对调控细胞凋亡有重要意义。

中医认为哮喘属于“哮证”，其病机主要为宿痰内伏于肺，复以外因诱发，以致痰随气升，气因痰阻，痰气互结，壅阻气道，肺气上逆。芍药甘草汤最早出自汉代张仲景的《伤寒杂病论》，由芍药和甘草两味中药等量组成，取其止咳、平喘功效，用于治疗哮喘、支气管炎等。现代药理学研究证实[15-16]，芍药甘草汤可解痉、镇痛，能有效抑制卵白蛋白致敏支气管哮喘小鼠的各类炎性细胞增生，抑制气道重构，产生良好的平喘作用。芍药总苷是芍药的主要有效成分，具有双向抗炎免疫调节作用；而甘草的有效成分甘草次酸则具有明显的皮质激素样作用，可通过抑制IgE和组胺的生物合成产生抗炎、抗过敏作用；二者合用可协同发挥作用。

本研究结果显示，西药组与联合组小鼠各项指标比较均无明显差异。与空白组相比，模型组IL-6、IL-13、IL-17、IgE水平显著升高；与模型组比较，各治疗组小鼠IL-6、IL-13、IL-17、IgE水平均显著降低；与西药组比较，中药组小鼠IL-6、IL-13、IL-17、IgE水平明显偏高。与空白组比较，模型组小鼠肺组织及气道Bcl-2阳性面积明显增高、Bax阳性面积明显降低；与模型组相比，各治疗组小鼠的肺组织及气道Bcl-2阳性面积均显著降低、Bax阳性面积均显著升高；与西药组比较，中药组小鼠肺组织及气道Bcl-2阳性面积明显偏高、Bax阳性面积明显偏低。表明芍药甘草汤能有效减轻气道炎症，阻止气道重塑，对RSV诱发哮喘急性加重有良好的治疗作用。

综上所述，芍药甘草汤可降低RSV诱发哮喘急性加重模型小鼠的IL-6、IL-13、IL-17等炎症因子水平，减轻气道炎症反应；提升Bax、降低Bcl-2蛋白表达，促进嗜酸粒细胞凋亡；降低LgE水平，提升免疫功能，对RSV诱发哮喘急性加重有良好的治疗作用。