穴位贴敷对高尿酸血症模型大鼠尿酸排泄的影响∗

何晓茜 唐雪青 刘佳男 吴雪梅 睢明河

（北京中医药大学，北京 100029）

高尿酸血症（HUA）的发病率日益升高严重危害着人类健康[1]，而目前上市的降尿酸药物副作用极大[2-5]。中药作为HUA常见的调理方法，有明显的临床疗效[6-7]，但HUA的调理是一个长期的过程，很多患者对口服中药有所排斥，长期服用中药也不免对患者脾胃及肝肾功能有所影响，故大多数患者很难长期坚持服药。针灸亦可有效降低HUA的血尿酸（SUA），并有助于减少肾脏损害[8]，但因治疗时间长且频繁、多数患者畏针怕疼，需要患者花费较大的治疗代价，所以大多数患者也很难长期坚持针灸。笔者认为穴位敷贴可以有效取代针灸，并将中药的临床疗效结合起来，达到事半功倍的效果，且使用起来经济、方便，相对而言治疗成本较低，尤其适用于临床上无症状型HUA患者的长期治疗，以维持体内尿酸的正常水平，但穴位贴敷治疗HUA的机制并不明确。经查阅资料发现，约有90%的原发性HUA的产生主要由于尿酸排泄减少所引起[9]，在排出的尿酸中有2/3是通过肾脏排泄，在肾脏排泄中肾小管的两次重吸收占有重要地位，其重吸收过程主要通过尿酸转运蛋白URAT1、GLUT9而实现[10-13]。本研究通过氧嗪酸钾灌胃建立HUA模型，观察SUA、血肌酐（SCr）的变化，计算并比较各组尿酸排泄指标，观察HE染色后的肾脏组织病理学变化，通过免疫组化法确定尿酸重吸收转运蛋白URAT1和GLUT9的表达水平，探讨穴位贴敷对HUA模型大鼠肾脏排泄尿酸的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6周龄SPF级雄性SD大鼠，32只，体质量（220±20）g，购于北京市维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2016-0006，饲养于北京中医药大学中药学院动物实验室。实验过程中对动物的处置符合北京中医药大学实验动物管理条例规定。

1.2 试药与仪器

氧嗪酸钾（Ark Pham：RPX989）；尿酸试剂盒（Beckman：AUZ5947）；肌酐试剂盒（Beckman：AUZ5089）；苏木素染液、分化液及返蓝液（Servicebio：G1004，G1039，G1040）；URAT1一抗（美国abcam：ab155287）；GLUT9一抗（武汉博士德：PB0915）；HRP山羊抗兔二抗（Ser⁃vicebio：GB23301）；假贴剂：将凡士林制成无药丸，直径约0.5 cm，重约0.3 g，并用胶带固定以制成贴剂。降酸贴：柴胡，芍药，泽泻，茯苓，白术，熟地黄，白芥子（北京同仁堂药业有限公司）以1∶1∶1∶1∶1∶2∶2比例混合，干燥后研磨成粉末，与凡士林混合制成直径约0.5 cm，重约0.3 g的药丸，并用胶带固定以制作贴剂。全自动生化分析仪（CX4Pro，美国Beckman），超低温冰箱（MDF-U50V，日本三洋）；脱水机（JJ-12J，武汉俊杰电子有限公司）；包埋机（JB-P5，武汉俊杰电子有限公司）；病理切片机（RM2016，上海徕卡仪器有限公司）；组织摊片机（KD-P，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；烤箱（DHG-9140A，上海慧泰仪器制造有限公司）；显微镜（XSP-C204，CIC）；Image Pro Plus软件（美国Media Cybernetics）。

1.3 分组与造模

将32只大鼠适应性喂养1周后采用随机法分为空白组、模型组、假贴敷组和穴位贴敷组，每组8只。除空白组外其余3组大鼠制备HUA模型，造模方法参考文献[14-15]：按10 mL/kg每天灌胃造模剂氧嗪酸钾[2 g（/kg·d）]进行造模，连续灌胃10 d后，改为隔日1次灌胃，直到实验结束。空白组同时灌胃10 mL/kg 0.9%氯化钠注射液，灌胃时间及用量同其余3组。实验第10日，氧嗪酸钾灌胃2 h后大鼠尾静脉取血，测定其SUA水平，若与空白组比较，其余大鼠的SUA升高，则证明造模成功。

1.4 干预方法

从造模的第11日开始，空白组正常饮食喂养，不进行干预。模型组正常饮食，适量抓取，不进行其他干预。假贴敷组正常饮食，用电推将腹部和背部穴区去毛备皮，用假贴剂贴敷于大鼠双侧肝俞和期门、脾俞和章门、肾俞和京门，6 h后去除，每日1次，连续5次为1个疗程，每个疗程结束后休息1 d，一共干预3个疗程，穴位贴敷组干预方法同假贴敷组，但使用降酸贴进行贴敷，从造模开始后第30 d取材。大鼠取穴参照《实验针灸学》：肝俞，脾俞，肾俞，期门，京门，章门[16]。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 血尿生化的测定 在造模的第10日，干预2 h后，从尾静脉采血3～5 mL；造模第27日，用代谢笼收集24 h尿液，期间正常饮食，记录24 h尿液体积（UV），在造模的第28日，大鼠禁食不进水24 h后，用10%的水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射进行麻醉，从腹主动脉中抽血5 mL。血液在静置1 h后，在4℃下以转速3 500 r/min离心10 min进行分离，并将上清液在-20℃下保存，待测定 SUA、SCr、尿尿酸（UUA）、尿肌酐（UCr）。

1.5.2 尿酸排泄分数的计算 1）24 h UUA=UV×UUA；2）FEUA%=UUA×SCr（/SUA×UCr）×100%；3）CUr=UV×UUA（/SUA×1440）。

1.5.3 肾脏组织切片观察 在冰板上取出左肾，并用4%的多聚甲醛固定，经脱水、包埋，切成5～8 μm的切片，80℃烤片1 h，二甲苯、乙醇脱水，苏木素染色5 min，1%盐酸酒精溶液分化5～10 s，水洗返蓝25 min，5%伊红染色2 min，乙醇、二甲苯脱水，通过光学显微镜观察大鼠肾脏组织，包括肾小球、肾小管和肾间质的病理变化。

1.5.4 肾脏尿酸重吸收转运蛋白URAT1、GLUT9检测 将4%多聚甲醛固定的肾脏组织，石蜡切片使用二甲苯和乙醇脱蜡，EDTA抗原修复缓冲液加热进行抗原修复，3%双氧水阻断内源性过氧化物酶，3%BSA室温进行血清封闭，加 URAT1一抗（1∶100，PBS稀释），GLUT9（1∶100，PBS稀释）（PBS为阴性对照），加入与一抗相应的二抗（HRP标记，1∶200稀释）室温孵育50 min，加入DAB显色液，苏木素复染3 min，苏木素返蓝液返蓝，酒精和二甲苯脱水，风干后封片。在显微镜下观察切片，并在显微镜下拍摄图像，各切片取6个互不重叠、不同倍数的视野。通过Image Pro Plus对免疫组织化学图像进行半定量分析，结果表示为平均光密度。

1.6 统计学处理

应用SAS19.0统计学软件对实验数据进行分析。计量资料以（±s）表示，组间差异做两样本均数比较t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠SUA、SCr水平的比较

见表1。在造模的第10日观察每组大鼠的SUA，与空白组比较，其他3组的SUA水平增加，差异有统计学意义（P＜0.01），提示造模成功。在造模的第28日，与空白组比较，模型组和假贴敷组SUA增加（P＜0.01或P＜0.05）；与模型组及假贴敷组比较，穴位贴敷组SUA降低（P＜0.01）。与空白组比较，模型组大鼠SCr水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与空白组和模型组比较，假贴敷组和穴位贴敷组大鼠SCr水平降低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠SUA、SCr水平的比较（μmol/L，±s）

表1 各组大鼠SUA、SCr水平的比较（μmol/L，±s）

与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与假贴敷组比较，□P＜0.05，□□P＜0.01。下同

组别空白组模型组假贴敷组穴位贴敷组n 7 6 7 7 10 d SUA 136.64±66.09 199.28±13.11△△203.50±27.19△△190.01±18.49△△28 d SUA 128.70±44.81 201.69±50.87△△178.62±69.71△91.77±18.78▲▲□□28 d SCr 28.13±4.76 28.63±3.05 23.11±2.80△▲20.43±1.38△▲

2.2 各组大鼠尿酸排泄指标24 h UUA、FEUA、CUr水平的比较

见表2。与空白组比较，其他3组24 h UUA、FEUA、CUr均减少，差异有统计学意义（P＜0.01），与模型组和假贴敷组比较，穴位贴敷组24 h UUA、FEUA、CUr水平增加（P＜0.01）。

2.3 各组大鼠肾脏组织病理学的比较

见图1。空白组肾脏结构正常，肾小球、肾小管结构清晰，未有炎症浸润、尿酸盐结晶。与空白组比较，模型组大鼠肾小球萎缩，肾小管扩张，排列紊乱，管腔内可见尿酸结晶，肾小管上皮细胞明显肿胀、坏死，空泡变性，包浆出现尿酸结晶，肾间质出现炎性细胞浸润。模型组和假贴敷组的病理变化相似。与模型组和假贴敷组比较，穴位贴敷组肾小球无明显萎缩，肾小管管腔扩张减少，管腔内偶见尿酸结晶，偶见肾小管上皮细胞被肿胀、坏死，肾间质少有尿酸结晶、炎细胞浸润。

表2 各组大鼠尿酸排泄指标24 h UUA、FEUA、CUr水平的比较（μmol/L，±s）

表2 各组大鼠尿酸排泄指标24 h UUA、FEUA、CUr水平的比较（μmol/L，±s）

组别空白组模型组假贴敷组穴位贴敷组n 7 6 7 7 24 h UUA（μmol）12 248.73±5 927.31 829.86±240.42△△549.02±160.18△△2 985.01±460.34△△▲▲□□FEUA（%）4.33±3.14 0.26±0.27△△0.16±0.10△△0.64±0.28△△▲▲□□CUr（mL/min）0.070±0.038 0.003±0.002△△0.002±0.001△△0.023±0.006△△▲▲□□

图1 肾皮质组织的组织学图像（免疫组化染色，200倍）

2.4 各组大鼠肾脏尿酸重吸收转运蛋白URAT1和GLUT9水平的比较

见图2～图3，表3。免疫组化显示URAT1表达于肾近曲小管管腔，GLUT9蛋白主要位于肾近曲小管顶膜。蛋白表达强弱可结合平均光密度半定量分析：空白组肾脏组织URAT1和GLUT9表达较弱，平均光密度低；与空白组比较，模型组和假贴敷组URAT1和GLUT9的表达呈强阳性，平均光密度升高（P＜0.05）；与模型组和假贴敷组比较，穴位贴敷组URAT1和GLUT9的平均光密度降低（P＜0.05）。

表3 各组大鼠尿酸重吸收转运蛋白URAT1和GLUT9表达水平的比较（±s）

表3 各组大鼠尿酸重吸收转运蛋白URAT1和GLUT9表达水平的比较（±s）

组别n URAT1GLUT9空白组模型组假贴敷组穴位贴敷组8 8 8 8 0.126±0.005 0.141±0.007△0.140±0.006△0.128±0.004▲□0.092±0.005 0.128±0.017△0.133±0.020△0.102±0.003▲□

图2 各组肾脏组织URA1表达（免疫组化染色，400倍）

图3 各组肾脏组织GLUT9表达（免疫组化染色，400倍）

3 讨论

3.1 指标的选取依据和结果分析

3.1.1 生化指标（SUA、SCr） SUA是反映人体内尿酸代谢正常与否的特异性指标[17]，本研究采用氧嗪酸钾通过抑制大鼠尿酸分解，减少尿酸排泄，制备HUA模型大鼠模型，造模10 d后，除空白组外，各组大鼠SUA明显增加，说明造模成功；此后持续造模，使大鼠在整个实验过程中维持高尿酸水平。在干预3个疗程后观察大鼠SUA的变化：与空白组比较，模型组和假贴敷组SUA明显升高；与模型组和假贴敷组比较，穴位贴敷组SUA明显降低，说明穴位贴敷可降低HUA模型大鼠的SUA水平。SCr是反应肾功能损伤的指标之一[18]。与空白组比较，模型组SCr无明显变化，说明该造模方法对肾脏功能没有损害，而假贴敷组和穴位贴敷组大鼠SCr水平降低，说明贴剂的束缚可能减少了大鼠的进食量，使贴敷后的大鼠较空白组和模型组营养降低。

3.1.2 尿酸排泄相关指标（24hUUA、FEUA、CUr） 肾脏排泄尿酸需经过4个过程：尿酸从肾小球滤过100%；在肾小管S1段被重吸收98%～100%；在S2段分泌50%的尿酸到肾小管中；在肾小管S3段再次重吸收40%～44%；最后排出体外的尿酸约有6%～10%。现已证实，超过90%的原发性HUA是由肾小管对尿酸的重吸收增加和（或）分泌减少所引起的[19]。有文献报道，24 h UUA、FEUA、CUr可以反映肾脏排泄尿酸水平[20]。与空白组比较，其他3组24 h UUA、FEUA、CUr减少，说明该HUA模型大鼠的尿酸排泄减少；与模型组和假贴敷组比较，穴位贴敷组24 h UUA、FEUA、CUr升高，说明穴位贴敷促进了尿酸的排泄。

3.1.3 肾脏病理学检测 光镜下观察肾脏组织病理学变化，显示高尿酸水平中的大鼠的肾脏组织形态结构发生了改变，出现炎性浸润，且有尿酸结晶堆积；而穴位贴敷组的大鼠肾脏组织病变不明显，少有炎性细胞，且尿酸结晶较少，表明穴位贴敷可有效清除肾脏组织中积累的尿酸，减轻高尿酸引起的肾脏组织病理改变。

3.1.4 尿酸重吸收转运蛋白的表达（URAT1、GLUT9）URAT1和GLUT9是肾小管中尿酸重吸收的主要转运蛋白，共同参与尿酸重吸收，尿酸从肾小管管腔经URAT1转运至肾小管上皮细胞，后经GLUT9介导由细胞内的尿酸进入到组织液和血液[21]。实验结果显示：URAT1和GLUT9主要表达在肾近曲小管的管腔和顶膜，与空白组比较，模型组和假贴敷组URAT1和GLUT9蛋白表达升高，尿酸重吸收增加，这可能是该模型大鼠SUA升高的原因之一。与模型组和假贴敷组比较，穴位贴敷组URAT1和GLUT9蛋白表达降低，说明穴位贴敷可以降低URAT1及GLUT9的蛋白的高表达，通过减少尿酸的重吸收，使SUA降低。

3.2 降酸贴穴位贴敷的中医治疗机制

中医学认为HUA与肝、脾、肾密切相关，为本虚标实证。由先天性禀赋不足或后天失养导致机体肾虚肝郁脾虚，患者正气不足、气血运行不畅，水谷精微代谢失常，从而造成痰浊瘀阻在体内堆积。

本实验穴位选用肝俞和期门、脾俞和章门、肾俞和京门，即肝脾肾的俞募穴作为治疗穴位：背俞穴指脏腑之气输注于背部的一些特定穴位，募穴指脏腑之气输注于胸腹部的穴位，临床常将病变脏腑的俞募配合使用，发挥协调作用，调节相关脏腑功能。降酸贴的成分选用临床已证实有效的方药，通过柴胡、芍药疏肝理气，熟地黄、泽泻滋阴补肾，白术、茯苓健脾利湿；并以白芥子刺激穴位。穴位刺激与药物传导相结合共同发挥作用，改善HUA模型大鼠肝郁脾虚肾虚的状态，排出痰浊瘀阻。

综上所述，穴位贴敷采用降酸贴作用于肝脾肾的俞募穴可能是通过抑制大鼠肾脏URAT1和GLUT9蛋白的高表达以减少尿酸的重吸收，促进尿酸排泄，发挥降低SUA的作用；并通过减少尿酸在肾脏的堆积，降低对肾脏的损害。但降酸贴的作用机制是否仅作用于肾脏还需进一步研究。