脑栓通胶囊对急性脑梗死模型大鼠炎症因子、MMP-9和TIMP-1表达及氧化应激指标的影响∗

郑玉兰 徐 贞 李如珊 林创明 马盛琴 刘云松

（广东祈福医院，广东 广州 511495）

急性脑梗死是因血栓导致脑动脉闭塞进而引起脑组织局部血液供应障碍，可导致不可逆局灶性脑损伤，其发病率高、致残率高以及死亡率高[1]。相关研究发现，急性脑梗死患者在发生和发展中多伴有炎症反应，氧化应激被认为是导致神经功能缺损的主要因素。近年研究发现，MMP-9/TIMP-1系统与脑梗死患者中血脑屏障损伤和修复密切相关[2]，可为缺血性脑血管病的治疗提供新思路。急性脑梗死属于中医“中风”范畴，气虚、瘀阻、血瘀是公认的中风病病因[3]。脑栓通胶囊具有活血通络、祛风化痰之功效。本研究通过建立急性脑梗死大鼠模型，以探讨脑栓通胶囊对急性脑梗死大鼠炎症因子、MMP-9和TIMP-1表达及氧化应激指标的影响，旨在为探讨脑栓通胶囊作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只SD大鼠，体质量（200±20）g，雌雄各半，购于上海邦耀生物科技有限公司。大鼠置于（23±2）℃室温中，12 h/12 h昼夜节律，自由饮水进食，适应环境7 d后于9∶00～17∶00进行实验。

1.2 试药与仪器

脑栓通胶囊（主要成分：蒲黄、赤芍、郁金、天麻、漏芦等；广东华南药业集团有限公司，国药准字Z20040093），给药剂量参照《药理实验方法学》[4]中人和动物体表面积折算的等效剂量比值表计算；尼莫地平片（拜耳医药保健公司，生产批号：L01984）。Anti-MMP9（Sigma公司），TIMP-1抗体（ab81282）（Abcam公司），β-Actin（SANTACRUZ公司），超敏ECL化学发光试剂盒（碧云天公司），Trizol试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）以及过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）以及白介素-6（IL-6）ELISA试剂盒和DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；C反应蛋白（CRP）试剂盒购于上海金穗生物科技有限公司，PBS缓冲液和二抗由碧云天生物技术研究所提供；其他试剂均为分析纯购于天津市广成化学试剂有限公司；氯化钠注射液（批号：181203）由山东康宁药业有限公司提供，实验用水为超纯水。TD5A-WS/TD5AWS型低速离心机（湖南湘仪离心机有限公司），164-5050型电泳仪（美国Bio-Rad公司），BX61型显微镜（日本OLYMPUS公司），Im⁃age-Pro Plus 6.0图像分析系统（麦克奥迪实业集团有限公司），pH计（北京屹源电子科技有限公司），超低温冰箱[冠森生物科技（上海）有限公司]，电子天平（上海良平仪器有限公司），控温水浴箱GKC（上海苏达实验仪器有限公司）。

1.3 造模与分组

参考文献[5]制备急性脑缺血大鼠模型，将模型组及用药组（阳性组和实验组）大鼠水合氯醛麻醉，俯卧固定于手术台，采用改良线栓法制作脑缺血大鼠模型，即分离并充分暴露大鼠的颈总动脉、颈内动脉以及颈外动脉，对颈总动脉近端和颈外动脉进行结扎，用血管夹夹闭颈内动脉，在颈总动脉剪一切口，将线栓经颈总动脉送至颈内动脉至大脑中动脉起始处，阻断血流2 h后将线栓取出恢复灌注。参照Zea Longa[6]法评分标准进行神经功能评分，1～3分表明造模成功。分组分笼饲养，不禁食水。假手术组大鼠仅用玻璃分针游离出双侧颈总动脉不做结扎处理。

1.4 给药方法

造模成功后，假手术组自由饮水进食，模型组开始灌服纯净水，实验组开始灌服脑栓通胶囊，剂量120 mg/kg，阳性组开始以10 mg/kg的剂量灌服尼莫地平。各组每天灌胃1次，连续7 d。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 神经功能评分 采用Bederson评分分级法，于术后7 d对各组大鼠进行神经行为学评分并记录结果。采用改良NSS评分标准对各组大鼠神经功能进行评分（16分制），得数越高，损伤程度越重。

1.5.2 炎症因子检测 7 d后收集3 mL腹动脉血，离心，分离血清，ELISA法检测TNF-α、IL-1β以及IL-6炎症因子水平，采用免疫比浊法检测CRP含量，严格按照试剂盒说明书操作。

1.5.3 MMP-9、TIMP-1表达检测 进行神经功能缺损程度评分后，采用水合氯醛溶液麻醉大鼠，断头取脑，于-80℃条件下冻存，在研钵内研磨粉碎，组织匀浆器匀浆。1）采用RT-PCR法检测MMP-9、TIMP-1基因表达，其中β-actin上游引物序列为5′-GAGGC CCAGAGCAAGAGAGGT-3′，下游引物序列为 5′-TTC ACGGTTGGCCTTAGGGTT-3′；MMP-3上游引物序列为5′-AAGGAGAGGCTGACATAATGA-3′，下游引物序列为 5′-ATCTGTCCATCGTTCATCATC-3′；TIMP-1 上游引物序列为 5′-GACCACCTTATACCAGCGTTA-3′，下游引物序列为5′-GTGCAAATTTCCGTTCCTTAA-3′。使用 Trizol试剂盒提取总 RNA，加入 20 μL DEPC水溶解，采用紫外分光光度计证实0.1 g琼脂糖凝胶电泳中含有两条带（18 s和28 s）用于反转录的标本，校正每组总RNA浓度，加入181 μL Oligod（T），72 ℃条件下变性10 min，取出立即置于冰上2 min。后加入11.5 μL DEPC水，2.5 μL 5Xbuffer，0.5 μL dNTP Mix⁃ture，0.5 μL RNase，0.5 μL M-MLV，室温下静置10 min。然后42℃水浴条件下1 h，冰上放置2 min。放入荧光定量PCR仪中，采用25 μL反应体系，观察荧光定量熔解度。2）采用Western blotting法检测MMP-9、TIMP-1蛋白的表达，提取总蛋白质后根据BCA蛋白浓度测定试剂盒操作步骤测定蛋白质浓度。使用荧光成像仪观察相关蛋白的表达，使用Image J分析软件分析所得图像中条带的光密度值，以靶蛋白β-actin灰度比值作为蛋白的相对表达丰度。

1.5.4 氧化应激指标测定 取大鼠脑浆液，离心，取上清液，采用硫代巴比妥酸比色法检测血清丙二醛（MDA）含量，采用黄嘌呤氧化酶法检测血清超氧物歧化酶（SOD）含量，采用紫外吸收法测过氧化氢酶（CAT）含量，采用比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH），严格按照试剂盒说明书操作。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能评分和神经行为学评分比较

见表1。与假手术组比较，模型组大鼠的神经功能评分和神经行为学评分明显高升高，具有显著差异（P＜0.05）。给予药物干预后，阳性组和实验组大鼠的神经功能评分和神经行为学评分明显低于模型组（P＜0.05），两组比较亦有显著性差异（P＜0.05）。

表1 各组大鼠神经功能评分和神经行为学评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠神经功能评分和神经行为学评分比较（分，±s）

与假手术组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与阳性组比较，△P＜0.05。下同

神经行为学评分00.00±00.00 5.72±1.12*3.28±0.49*#3.05±0.52*#△组别假手术组模型组阳性组实验组n 15 15 15 15神经功能评分0.00±0.00 5.86±1.21*3.63±0.81*#3.12±0.76*#△

2.2 各组大鼠炎症因子比较

见表2。与假手术组比较，模型组大鼠的TNF-α、CRP、IL-1β以及 IL-6水平明显升高（P＜0.05）。给予药物干预后，阳性组和实验组大鼠的炎症因子水平明显降低（P＜0.05），两组比较有显著差异（P＜0.05）。

表2 各组大鼠炎症因子比较（μg/mL，±s）

表2 各组大鼠炎症因子比较（μg/mL，±s）

组别假手术组模型组阳性组实验组n 15 15 15 15 TNF-α 39.89±6.16 54.75±7.08*47.09±7.14*#41.28±7.32*#△CRP 32.14±4.59 51.23±3.12*40.12±3.74*#35.47±5.26*#△IL-1β 4.53±0.67 6.72±0.85*4.66±0.54*#4.69±0.71*#△IL-6 21.12±2.67 30.47±3.86*23.57±3.45*#23.87±3.09*#△

2.3 各组大鼠MMP-9和TIMP-1表达比较

见表3，图1。与假手术组比较，模型组大鼠的MMP-9基因表达和MMP-9蛋白表达的相对丰度值明显升高，TIMP-1基因表达和TIMP-1蛋白表达的相对丰度值明显降低，具有显著差异（P＜0.05）。给予药物干预后，阳性组和实验组大鼠的MMP-9基因表达和MMP-9蛋白表达的相对丰度值明显低于模型组，TIMP-1基因表达和TIMP-1蛋白表达的相对丰度值明显高于模型组（P＜0.05），两组比较亦有显著差异（P＜0.05）。

表3 各组大鼠MMP-9和TIMP-1表达比较（±s）

表3 各组大鼠MMP-9和TIMP-1表达比较（±s）

组别假手术组（n=15）模型组（n=15）阳性组（n=15）实验组（n=15）基因表达蛋白表达的相对丰度值基因表达蛋白表达的相对丰度值基因表达蛋白表达的相对丰度值基因表达蛋白表达的相对丰度值MMP-9 0.656±0.045 0.597±0.084 1.572±0.206*0.942±0.091*0.908±0.108*#0.734±0.041*#0.723±0.10*#▲0.617±0.037*#▲TIMP-1 10.471±1.716 0.743±0.094 8.037±1.038*0.483±0.027 9.053±1.101*#0.548±0.100*#9.721±1.526*#▲0.619±0.091*#▲

图1 各组大鼠MMP-9、TIMP-1蛋白表达

2.4 各组大鼠氧化应激指标比较

见表4。与假手术组比较，模型组大鼠的MDA水平明显升高，SOD、GSH以及CAT水平明显降低，具有显著差异（P＜0.05）。给予药物干预后，阳性组和实验组大鼠的MDA水平明显低于模型组，SOD、GSH以及CAT水平明显高于模型组（P＜0.05），两组比较有显著性差异（P＜0.05）。

表4 各组大鼠氧化应激指标比较（±s）

表4 各组大鼠氧化应激指标比较（±s）

组别假手术组模型组阳性组实验组n 15 15 15 15 MDA（mmol/mL）5.27±1.13 10.81±2.53*7.24±1.34*#6.32±1.51*#△SOD（U/mL）180.81±20.27 116.68±15.46*142.85±21.32*#136.89±13.31*#△GSH（U/mg）46.07±2.57 18.63±1.84*34.53±0.78*#29.56±0.81*#△CAT（U/mg）5.67±1.08 1.93±0.65 3.19±0.36 2.50±0.21*#△

3 讨论

急性脑梗死是一种炎症相关性疾病[7-8]，脑缺血后存在炎症反应，而炎症反应释放大量的氧自由基、一氧化氮、兴奋性氨基酸等毒性物质，可明显造成脑组织不可逆的损伤，可诱发神经细胞凋亡，加重脑损伤[9]。研究证实，TNF-α、IL-1β、IL-6以及CRP均参与急性脑梗死的发生发展过程。TNF-α是炎症反应的起始因子，可诱导动脉粥样硬化的形成，促进脑神经细胞凋亡[10]。IL-1β通过激活内皮细胞促使血栓形成，或增加诱导细胞间黏附分子表达，使大量中性粒细胞浸润到脑组织，诱发炎性反应，是脑缺血损伤的病理生理基础。CRP与低密度脂蛋白特异性结合后，可刺激黏附分子大量产生，进而损害血管内皮功能。

研究发现，MMP-9/TIMP-1与急性脑梗死患者脑梗死的梗死面积、出血转化及预后密切相关[11-12]，是其损伤和修复的关键启动因素。研究MMP的特殊抑制剂或提高内源性TIMP水平，开发具有调控MMP/TIMP平衡的治疗方法，将为缺血性脑卒中的治疗提供新的思路。MMPs作为金属蛋白酶参与BBB完整性以及脑梗死溶栓后出血转化，其中MMP-9与BBB完整性破坏的关系最为密切[13]。TIMP-1由巨噬细胞和结缔组织细胞产生，其分泌受多种细胞因子影响，可对MMP-9产生抑制作用。

氧化应激是缺血性脑血管疾病中尤为重要的一个发病机制。急性脑梗死可使氧自由基大量产生，增加氧化应激反应，诱导神经毒性损伤导致神经元死亡[14]。SOD为清除氧自由基的特异性酶，是清除自由基连锁反应的标志物[15]。MDA是细胞膜脂质过氧化产生的稳定代谢物。CAT是抗氧化酵素系统的重要一员，可发生过氧化氢的歧化，使细胞免于遭受H2O2的毒害[16]。GSH是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，与SOD一起参与细胞中抗氧化作用。

中医认为急性局灶性脑缺血因痰瘀互结、脑脉不通所致，兼夹气血、脾胃升降失调，治宜活血醒脑开窍。脑栓通胶囊由蒲黄、赤芍、郁金、天麻、漏芦组成，具有活血通络，祛风化痰之功效，用于风痰瘀血痹阻脉络引起的缺血性中风病中经络急性期和恢复期。方中蒲黄、赤芍化瘀止痛；郁金活血行气、止痛解郁；天麻熄风止痉、平抑肝阳、祛风通络；漏芦清热解毒散结，诸药合用具有活血通络，祛风化痰之功效。现代药理学研究发现[17]，脑栓通胶囊可降低血瘀模型大鼠的全血黏度、全血还原黏度、血浆黏度，延长血栓形成时间，可有效抑制对结扎双侧颈总动脉致实验性不完全缺血模型大鼠的脑血管通透性，改善大脑中动脉阻塞致局灶性脑缺血模型大鼠的神经症状，降低脑梗死范围。

本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠的神经功能评分和神经行为学评分、TNF-α、CRP、IL-1β以及IL-6水平、MMP-9基因表达和MMP-9蛋白表达的相对丰度值以及MDA水平明显高升高，TIMP-1基因表达和TIMP-1蛋白表达的相对丰度值、SOD、GSH以及CAT水平明显降低，具有显著差异。药物干预后，阳性组和实验组大鼠的神经功能评分和神经行为学评分、炎症因子、MMP-9基因表达和MMP-9蛋白表达的相对丰度值明显低于模型组，TIMP-1基因表达和TIMP-1蛋白表达的相对丰度值、SOD、GSH以及CAT水平明显高于模型组，两组比较均有显著差异。提示脑栓通胶囊能有效地降低急性脑梗死大鼠的神经功能评分和神经行为学评分，降低炎症因子和自噬相关蛋白水平，减轻氧化应激反应。

综上所述，脑栓通胶囊可有效地降低急性脑梗死模型大鼠炎症因子水平，改善MMP-9和TIMP-1表达，减轻其氧化应激指标。